Наша рассылка!
Новости сайта Модно-Красиво.ру Вы можете получать прямо на мейл
Рассылки Subscribe.Ru

Подписаться письмом

Что такое пцр в медицине


что это такое, как проводится исследование, методы диагностики заболеваний

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.


ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

  • ВИЧ;
  • герпеса;
  • различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
  • кандидоза;
  • гепатитов;
  • мононуклеоза;
  • листериоза;
  • цитомегаловируса;
  • туберкулеза;
  • вируса папилломы человека;
  • клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Кстати
Метод ПЦР применяется не только в медицинских целях. В наши дни он используется и в иных сферах, например в криминалистике, в тех случаях, когда требуется определить, кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал. ПЦР иногда используется также при установлении отцовства.


Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Расшифровка результатов

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

www.kp.ru

сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» - ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) - уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории


Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами - изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.
Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).


Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

www.labquest.ru

Полимеразная цепная реакция в реальном времени — Википедия

В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. Real-time PCR, qPCR, qRT-PCR) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесённой ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце[1].

Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода — флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани[2].

Процедура очень похожа на процедуру классической ПЦР, то есть присутствуют все стадии реакции — плавление или денатурация двухцепочечных ДНК при температуре 95˚C, отжиг праймеров (температура отжига зависит от используемых праймеров) и элонгация при температуре 72˚С, если используется Taq-полимераза. Принцип ПЦР в реальном времени заключается в детекции ПЦР-продукта по мере его накопления. Сегодня это возможно сделать благодаря высокоспецифичным флуоресцентным зондам. Существует два основных подхода генерации света у таких зондов — во время элонгации и отжига, но, в обоих случаях флуоресценция усиливается с каждым новым циклом. Таким образом, сила сигнала говорит о первоначальном количестве интересующей молекулы[3].

На начальных этапах флуоресценция слабая, так как продукта ещё не очень много, поэтому её трудно отличить от фона. По мере накопления продукта, сигнал растёт сначала экспоненциально, а затем выходит на плато. Выход на плато объясняется нехваткой того или иного компонента реакции — могут закончиться праймеры, нуклеотидилтрифосфаты, метка. Если продукта реакции накопилось слишком много, то лимитирующим фактором может стать фермент, и тогда зависимость количества продукта от цикла станет линейной. Стоит отметить, что в стандартной реакции ПЦР в реальном времени все образцы выйдут на плато и достигнут примерно одного уровня сигнала. Таким образом, конечная точка ничего не скажет о начальном количестве исследуемого образца. С другой стороны, в экспоненциальной фазе можно проследить отличия в скорости роста продукта. Различия в начальном количестве молекул влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума[4].

Количество циклов, необходимое для того, чтобы флуоресценция достигла порогового уровня (над шумом) называется СТ-величиной. Пороговый уровень — не строго определённая величина, может подбираться для каждого случая отдельно.

Однако СТ-величина может зависеть от многих случайных факторов, например чувствительности детектора, качество фильтра и так далее. Поэтому точно начальное количество интересующего продукта померить нельзя. Для решения этой проблемы существуют методы нормировки. Измеряют отношение количеств двух молекул в пробе. Нормируют обычно на продукты генов домашнего хозяйства — таких генов, количество которых в клетке всегда примерно одинаковое (Пример — ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции у бактерий). Соотношение определяют по следующей формуле: [N0 ]A/[N0 ]B = (1+E)(CTB-CTA)

Где [N0 ]A и [N0 ]B — начальные количества двух образцов, CTB и CTА — соответствующие CT-величины, а E — эффективность ПЦР, которая часто приравнивается к 1 или 0.9[4].

Разнообразие зондов[править | править код]

Мечение двуцепочечной ДНК[править | править код]

В данном случае меткой служит химическое соединение, способное интеркалировать в двойную спираль ДНК. Такой зонд меняет свою конформацию при взаимодействии с продуктами ПЦР и становится флуорофором. Детекцию можно проводить в конце каждого цикла, перед стадией денатурации. Примером такой краски может служить широко используемый SYBR Green.

Метка, работающая в фазу элонгации[править | править код]

Существует другой способ использования зондов, к которым с 5’ и 3’ концов пришиты флуорофор и его гаситель. Если последовательность зонда не очень длинная, то даже в связанном с ДНК состоянии два химических реагента будут взаимодействовать друг с другом, и не будет испускаться флуоресценция. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, по одному нуклеотиду диссоциирует зонд от ДНК-мишени. В результате этого процесса и флуорофор и его гаситель попадут в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится[3].

Метки, работающие в фазу отжига[править | править код]
Флуорогенная шпилька[править | править код]

Флуорогенная шпилька — небольшая одноцепочечная молекула ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать [пространственную структуру| вторичная структура ДНК] — шпильку. На один конец цепочки пришивают флуорофор, а на второй — вещество, его гасящее. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В таком случае те молекулы зонда, которые плавают в растворе, не будут давать флуоресцентный сигнал, а связавшиеся с молекулами ДНК будут претерпевать конформационные изменения, в результате которых произойдет пространственное разнесение флуроофора и его гасителя и восстановление флуоресценции. Детекцию целесообразно проводить после денатурации[3].

Метка, основанная на методе FRET[править | править код]

Другой вариант мечения вновь-образующегося ПЦР-продукта основывается на методе FRET. Основа этого метода — наличие двух зондов, которые связываются с ДНК-мишенью на небольшом расстоянии друг от друга. На 5’-конец одного зонда и 3’-конец второго пришиты флуорофор-донор и флуорофор-акцептор соответственно. При их близком расположении происходит следующее: флуорофор-донор поглощает свет определённой длины волны и испускает свечение в более длинноволновом спектре. Эту волну, в свою очередь, поглощает флуорофор-акцептор и испускает свет, который можно детектировать[3].

Можно также использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. В таком случае появляется возможность в одной пробирке детектировать сигнал от разных молекул ДНК. Метод носит название множественный ПЦР (multiplex PCR).

ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции[править | править код]

Метод был изобретён для детекции количества ДНК в пробе, однако, последнее время все чаще используется немного видоизменённый количественный ПЦР для детекции РНК. Метод носит название ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-кПЦР , RT-qPCR). Этот метод широко используется для характеризации или сравнения уровней мРНК в разных популяциях[5].

Прежде, чем проводить стандартный ПЦР в реальном времени, нужно провести реакцию обратной транскрипции, для синтеза кДНК. Реакция обратной транскрипции проводится с помощью фермента — обратной-транскриптазы (РНК-зависимой ДНК полимеразы, ревертазы). Реакцию можно проводить без добавления праймера, однако наибольшая эффективность достигается, когда праймер добавлен. Существует три основных типа праймеров:

  1. Олиго dT праймеры — гибридизуются с polyA последовательностью, которая есть на 3’ -конце многих эукариотических мРНК.
  2. Случайная последовательность. Обычно используют либо гексамеры, либо нонамеры. Такие последовательности могут транскрибировать все мРНК
  3. Ген-специфичные праймеры используются, когда исследуется мРНК, экспрессируемая с определённого гена[4].

Реакция обратной транскрипции — ключевой этап в данном подходе, так как количество кДНК должно соответствовать количеству изучаемой мРНК. РНК-молекула менее стабильна, чем ДНК, поэтому при выделении РНК и проведении ОТ-кПЦР нужно тщательно следить за чистотой процедур и не допускать попадания большого количества РНКаз.

Полуколичественная ПЦР[править | править код]

Полуколичественная ПЦР (semi-quantitative PCR) — немного модифицированный метод количественного ПЦР с реакцией обратной транскрипции. Он часто используется для сравнения экспрессии нескольких генов. В данном случае измеряют количество накопленного продукта только в одной точке — после остановки реакции. ПЦР реакция останавливается, когда предполагается, что накопление продукта находится в экспоненциальной фазе роста и ПЦР-продукт можно детектировать. Далее, после электрофореза или саузерн-блота, можно измерить разницу в экспрессии нескольких образцов[5]. Использование данного метода критикуется в профессиональной среде, т.к. данный метод подразумевает оценку "на глазок".

ПЦР в реальном времени широко используется для решения многих исследовательских задач в лабораториях. Кроме того, этот метод нашёл применение в медицине (для диагностики заболеваний) и в сфере биотехнологий (для определения содержания микроорганизмов в продуктах питания и растительных материалах; для детекции ГМО). Также кПЦР используется для генотипирования вирусов и других патогенов человека и определения их количественного содержания.

Диагностические исследования[править | править код]

Количественная ПЦР применяется для быстрого выявления генов или фрагментов ДНК, являющихся маркерами инфекционных заболеваний, генетических отклонений и т. д. Внедрение этого метода в клинические лаборатории значительно улучшило качество диагностики инфекционных заболеваний[6]. Кроме того, кПЦР используется в качестве инструмента для детектирования вновь возникающих заболеваний. Например, новых штаммов гриппа[7].

Использование кПЦР также позволяет проводить количественные измерения и генотипирование (характеристика штаммов) вирусов, например, вируса гепатита B[8]. Степень инфекции, которая оценивается, как число копий вирусного генома на единицу ткани пациента, имеет большое значение во многих случаях. Например, вероятность реактивации вируса простого герпеса типа 1 зависит от количества инфицированных ганглиев[9]. В зависимости от того, интегрировал ли вирус в геном пациента (как, например, в случае вируса папилломы человека) или нет, количественный анализ осуществляется с применением обратной транскрипции или без неё.

Количественная ПЦР также широко используется для детекции опухолевых клеток в материале из со́лидных опухолей[10][11] и даже при некоторых формах лейкемии[12][13].

Выявление циркулирующих опухолевых клеток[править | править код]

Рак молочной железы все ещё является наиболее частой причиной смерти среди раковых больных. Причём, часто смерть вызвана не только самой опухолью, но и возникшими метастазами. Сами метастазы возникают в результате того, что особенные клетки, способные к пролиферации, отделяются от опухоли, выходят в кровяное русло и вторично поселяются в какой-то части организма. Эти клетки называются циркулирующими стволовыми клетками (ЦСТ). Присутствие таких клеток в крови пациентов, больных раком молочной железы, как правило, связано с плохим прогнозом исхода терапии и выживаемости в целом, поэтому является очень важным диагностическим параметром. Но из-за очень низкого количества, выявление ЦСТ — является довольно трудной задачей. И кПЦР, как высокочувствительный метод, может быть использован для решения этой проблемы. Дело в том, что, как и все раковые клетки, ЦСТ имеют эпителиальной происхождение и, следовательно экспрессируют определённый набор генов, отличающийся от окружающих их клеток крови, имеющих мезенхимальное происхождение. Для применения этого метода необходимо определить набор генов-маркеров ЦСТ и оценить их уровень экспрессии[14].

В микробиологии[править | править код]

ПЦР в реальном времени также применяется для микробиологических работ в сфере безопасности продуктов питания, для оценки качества вод (питьевых и сточных) и в сфере здравоохранения[15]. Кроме того, данный метод используется для идентификации кишечной микрофлоры[16].

Научные исследования[править | править код]

В ходе проведения исследований, кПЦР в основном используется для проведения количественных измерений транскрипции генов. Данный метод широко применяется для оценки изменений во времени экспрессии определённого гена, например, в ответ на введение лекарственного средства или изменения условий окружающей среды . Он также используется для определения зиготности трансгенных животных, используемых в исследовании. Для решения некоторых задач данный метод специально модифицируется

кПЦР для определения количества малых ядрышковых РНК (мяРНК)[править | править код]

мяРНК отличаются по свойствам от мРНК тем, что имеют очень малую длину (около 22 нуклеотидов), не имеют консервативной последовательности на концах, при этом мяРНК одной популяции могут отличаться на один или несколько нуклеотидов. Для решения этих проблем используют подходы, основанные на добавлении небольшого участка ДНК (линкера) к кДНК в реакции обратной транскрипции. Затем проводится ПЦР в реальном времени стандартными способами с использованием праймеров, комплементарных линкеру[17].

ПЦР в реальном времени для измерения количества белка[править | править код]

Для измерения количества белка в клетке используют следующий подход:

  1. Создают два вида антител к целевому белку с пришитыми последовательностями ДНК таким образом, что при взаимодействии с белком, 3’ конец одной последовательности оказывается недалеко от 5’-конца второй ДНК последовательности.
  2. Получается, что каждой молекуле белка соответствует известная нам последовательность ДНК, количество которой потом можно анализировать с помощью классического кПЦР-анализа[18].

Обнаружение фитопатогенов[править | править код]

Агропромышленность стремится производить семена и рассаду, не содержащую патогенных микроорганизмов, с целью предотвращения экономических потерь и увеличения срока хранения. Поэтому были разработаны системы, позволяющие обнаружить небольшие количества ДНК фитофторы (Phytophthora ramorum), оомицетов и некоторых других патогенов, которые приводят к гибели дубов и других видов растений, в смеси с ДНК растения-хозяина. Возможность различить ДНК возбудителя и растения-хозяина основана на амплификации последовательностей ITS (internal transcribed spacer), внутренних транскрибируемых участков, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона[19].

Детекция генетически модифицированных организмов[править | править код]

кПЦР (с использованием обратной транскрипции) может быть использована для детекции ГМО (генетически модифицированных организмов), так как является более чувствительным по сравнению со многими другими методами. При этом специфические праймеры используются для амплификации промотора, терминатора или даже промежуточных последовательностей, используемых в процессе создания вектора. Так как процесс создания трансгенного растения обычно приводит к вставке более, чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается с помощью кПЦР. При этом в качестве контроля используют растение, содержащее данный ген в единственном экземпляре[20][21].

  1. VanGuilder H. D., Vrana K. E., Freeman W. M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis (англ.) // Biotechniques (англ.)русск. : journal. — 2008. — Vol. 44. — P. 619—626. — doi:10.2144/000112776. — PMID 18474036.
  2. Nolan T., Hands R. E., Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. (англ.) // Nat. Protoc. (англ.)русск. : journal. — 2006. — Vol. 1. — P. 1559—1582. — doi:10.1038/nprot.2006.236. — PMID 17406449.
  3. 1 2 3 4 Provenzano M., Mocellin S. Complementary techniques: validation of gene expression data by quantitative real time PCR. (англ.) // Advances In Experimental Medicine And Biology. — 2007. — Vol. 593. — P. 66—73. — doi:10.1007/978-0-387-39978-2_7. — PMID 17265717. [исправить]
  4. 1 2 3 Kubista M., Andrade J. M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., Sindelka R., Sjöback R., Sjögreen B., Strömbom L., Ståhlberg A., Zoric N. The real-time polymerase chain reaction. (англ.) // Molecular Aspects Of Medicine. — 2006. — April (vol. 27, no. 2-3). — P. 95—125. — doi:10.1016/j.mam.2005.12.007. — PMID 16460794. [исправить]
  5. 1 2 Bustin S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. (англ.) // Journal Of Molecular Endocrinology. — 2002. — August (vol. 29, no. 1). — P. 23—39. — PMID 12200227. [исправить]
  6. ↑ Sails AD (2009). «Applications in Clinical Microbiology». Real-Time PCR: Current Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  7. FDA Authorizes Emergency Use of Influenza Medicines, Diagnostic Test in Response to Swine Flu Outbreak in Humans. FDA News, April 27, 2009.
  8. Yeh S. H., Tsai C. Y., Kao J. H., Liu C. J., Kuo T. J., Lin M. W., Huang W. L., Lu S. F., Jih J., Chen D. S., Chen P. J. Quantification and genotyping of hepatitis B virus in a single reaction by real-time PCR and melting curve analysis. (англ.) // Journal Of Hepatology. — 2004. — October (vol. 41, no. 4). — P. 659—666. — doi:10.1016/j.jhep.2004.06.031. — PMID 15464248. [исправить]
  9. Sawtell N. M. The probability of in vivo reactivation of herpes simplex virus type 1 increases with the number of latently infected neurons in the ganglia. (англ.) // Journal Of Virology. — 1998. — August (vol. 72, no. 8). — P. 6888—6892. — PMID 9658140. [исправить]
  10. Cen P., Ni X., Yang J., Graham D. Y., Li M. Circulating tumor cells in the diagnosis and management of pancreatic cancer. (англ.) // Biochimica Et Biophysica Acta. — 2012. — December (vol. 1826, no. 2). — P. 350—356. — doi:10.1016/j.bbcan.2012.05.007. — PMID 22683404. [исправить]
  11. Young R., Pailler E., Billiot F., Drusch F., Barthelemy A., Oulhen M., Besse B., Soria J. C., Farace F., Vielh P. Circulating tumor cells in lung cancer. (англ.) // Acta Cytologica. — 2012. — Vol. 56, no. 6. — P. 655—660. — doi:10.1159/000345182. — PMID 23207444. [исправить]
  12. Brüggemann M., Gökbuget N., Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring minimal residual disease as a therapeutic principle. (англ.) // Seminars In Oncology. — 2012. — February (vol. 39, no. 1). — P. 47—57. — doi:10.1053/j.seminoncol.2011.11.009. — PMID 22289491. [исправить]
  13. DiNardo C. D., Luger S. M. Beyond morphology: minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia. (англ.) // Current Opinion In Hematology. — 2012. — March (vol. 19, no. 2). — P. 82—88. — doi:10.1097/MOH.0b013e3283501325. — PMID 22314322. [исправить]
  14. Andergassen U., Kölbl A. C., Hutter S., Friese K., Jeschke U. Detection of Circulating Tumour Cells from Blood of Breast Cancer Patients via RT-qPCR. (англ.) // Cancers. — 2013. — 25 September (vol. 5, no. 4). — P. 1212—1220. — doi:10.3390/cancers5041212. — PMID 24202442. [исправить]
  15. ↑ Filion, M (editor) (2012). Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology.Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0.
  16. Nobre Giselle, S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotics: The Effects on Human Health and Current Prospects (англ.) // Probiotics. — 2012. — 3 October. — ISBN 9789535107767. — doi:10.5772/50048. [исправить]
  17. Benes V., Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. (англ.) // Methods (San Diego, Calif.). — 2010. — April (vol. 50, no. 4). — P. 244—249. — doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.026. — PMID 20109550. [исправить]
  18. Swartzman E., Shannon M., Lieu P., Chen S. M., Mooney C., Wei E., Kuykendall J., Tan R., Settineri T., Egry L., Ruff D. Expanding applications of protein analysis using proximity ligation and qPCR. (англ.) // Methods (San Diego, Calif.). — 2010. — April (vol. 50, no. 4). — P. 23—26. — doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.024. — PMID 20215017. [исправить]
  19. Baldwin B. G. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the compositae. (англ.) // Molecular Phylogenetics And Evolution. — 1992. — March (vol. 1, no. 1). — P. 3—16. — PMID 1342921. [исправить]
  20. Holst-Jensen A., Rønning S. B., Løvseth A., Berdal K. G. PCR technology for screening and quantification of genetically modified organisms (GMOs). (англ.) // Analytical And Bioanalytical Chemistry. — 2003. — April (vol. 375, no. 8). — P. 985—993. — doi:10.1007/s00216-003-1767-7. — PMID 12733008. [исправить]
  21. Brodmann P. D., Ilg E. C., Berthoud H., Herrmann A. Real-time quantitative polymerase chain reaction methods for four genetically modified maize varieties and maize DNA content in food. (англ.) // Journal Of AOAC International. — 2002. — May (vol. 85, no. 3). — P. 646—653. — PMID 12083257. [исправить]
  • Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — Москва: Мир, 2002. — 589 с. — ISBN 5030033289.

ru.wikipedia.org

Что такое ПЦР | Применение ПЦР в медицине

Никогда ещё в истории медицины врачи не имели столь точного, быстрого и эффективного метода диагностики инфекционных заболеваний, как ПЦР или полимеразная цепная реакция. Широко внедрённый на сегодняшний день метод имеет ряд значительных преимуществ, позволяющих считать, что ПЦР - единственный метод, имеющий почти 100% точность.

ПЦР была изобретена в США. Автор этого открытия Кери Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию в области химии. Учёным давно был необходим метод, позволяющий получить неограниченное число копий исходной ДНК или РНК. ПЦР в течение нескольких лет использовалась как экспериментальный метод. Широкое внедрение ПЦР в клиническую практику началось в конце 80-х - начале 90-х годов.

Каким образом проводится анализ ПЦР?

В основе метода - увеличение количества определённых последовательностей искомой ДНК, характерной для того или иного возбудителя инфекции. Наборы ПЦР реактивов, характерных для определённого возбудителя, загружаются в специальный аппарат. Туда же добавляют образцы, полученные от больного. Возможно проводить анализ с любыми образцами – такими, как кровь, слюна, мазок. ПЦР отличается низкими требованиями к чистоте образцов. Можно исследовать даже кал.

На ПЦР аппарате запускается циклический процесс нагревания и охлаждения смеси реактивов и образцов. В ходе циклов, если в смеси находится последовательность ДНК, характерная для какого-либо инфекционного агента, происходит многократное увеличение копий ДНК или РНК возбудителя.

Когда количество копий ДНК или РНК возбудителя достигает количества, достаточного для обнаружения, можно провести качественный или количественный анализ. Наличие искомой ДНК свидетельствует о положительном результате - обнаружена последовательность нуклеотидов, характерная для возбудителя инфекции или для наследственной патологии.

Количественный ПЦР анализ позволяет определить, как много вирусов содержится в образцах. Таким образом, определяется тяжесть вирусной инфекции, называемая вирусной нагрузкой.

В тех случаях, если ПЦР отрицательный - можно с уверенностью сказать, что искомой патологии у человека нет.

Лаборатория ПЦР диагностики представляет собой сложный комплекс оборудования и реактивов. По этой причине анализ достаточно дорог.

Так как метод определяет последовательности ДНК, ПЦР широко используется и для других целей: в криминалистике, для установления факта отцовства, в молекулярной биологии и химии для проведения экспериментов.

Почему ПЦР - лучший из доступных сегодня методов диагностики

Плюсы ПЦР диагностики:

1. Широта диагностических возможностей - с помощью ПЦР можно определять все виды вирусных, бактериальных и грибковых инфекций.

2. Доступность - сегодня ПЦР проводится в любой частной или государственной клинике.

3. ПЦР может использовать для анализа любые образцы тканей или биологических жидкостей.

4. ПЦР - очень точный метод. Другой метод, применяющийся для диагностики инфекции, называемый иммуноферментный анализ или ИФА, в 30-40% случаев, по данным различных исследований, не обнаруживает возбудителя.

5. ПЦР определяет самого возбудителя, в отличие от серологических методов. (Серологические методы основаны на определении антигенов или антител к возбудителю в сыворотке крови. Для этого инфекция должна какое-то время существовать в организме больного. Например, первые месяцы после заражения ВИЧ, серологические методы не дают положительных результатов, несмотря на то, что болезнь уже началась. Этот период называют серонегативным окном. ПЦР лишена этого недостатка).

6. ПЦР - высокоспецифичный метод. У него нет таких недостатков, как ложно-положительные или ложно-отрицательные результаты. Ошибки метода полимеразной цепной реакции скорее зависят от человеческого фактора.

Как выглядят результаты ПЦР

Результаты ПЦР анализа на инфекции обычно выглядят как таблица. В первой колонке идут виды возбудителей, определённых в ходе анализа. Во второй результаты. Например:

Возбудитель

Результат

HCV (ПЦР)

отр.

Микоплазма (ПЦР)

отр.

ВИЧ (ПЦР)

отр.

Хламидия (ПЦР)

отр.

В списке может быть много инфекций. В скобках указывается, что анализ был проведён с помощью полимеразной цепной реакции. Таблица упрощена, так как одних микоплазм существует несколько разных видов.

В спорных случаях, возникающих при положительных результатах на такие страшные диагнозы, как ВИЧ, полученные другими методами, ПЦР выступает в роли решающего метода, подтверждающего или исключающего диагноз.

www.probirka.org

Полимеразная цепная реакция (ПЦР анализ): описание метода, диагностика

ПЦР анализ, или полимеразная цепная реакция, — метод ДНК — диагностики, основанный на многократном увеличении молекул ДНК и РНК, характерных для того или иного патогенного микроорганизма. Для увеличения скорости копирования нуклеиновых кислот используются ДНК и РНК ферменты.

ДНК — диагностика: ПЦР анализ, достоинства метода

ДНК — диагностика — это один из наиболее современных, высокотехнологичных методов исследования в лабораторной диагностике.

  • Полимеразная цепная реакция, или ПЦР анализ, позволяет выявить в организме человека многие инфекционные заболевания, которые были вызваны вирусами  или возбудителями бактериальной природы.
  • С помощью данного анализа можно обнаружить болезни не только в острой стадии, но и во время инкубационного (скрытого) периода.

Данный метод исследования обладает многими преимуществами:

  • Возможность обнаружить конкретного возбудителя и целого ряда микроорганизмов;
  • Высокая точность: вероятность ложных результатов ничтожно мала;
  • Диагностика скрытых, вяло текущих заболеваний, не беспокоящих какими-либо проявлениями;
  • Быстрое получение результатов;
  • Использование биологического материала различного рода: крови, плазмы, сыворотки крови, мочи, кала, биологических  жидкостей, мокроты, слизи, выделений;
  • ПЦР анализ может быть качественный и количественный, то есть, не только выявлять вид возбудителя болезни, но и давать информацию о его количественном содержании в организме.

Описание, анализ крови методом ПЦР 

Одним из самых распространенных видов исследования является анализ крови методом полимеразной цепной реакции, ПЦР;

  • Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач.
  • В устоявшейся клинической практике ПЦР  анализы обычно сдают блоками, на определенные группы конкретных возбудителей. Например:

ПЦР — диагностика инфекций, передающихся половым путем, где одновременно выявляются:

ПЦР — диагностика бактериальных инфекций:

ПЦР — диагностика  вирусных инфекций,   ( вирусных гепатитов, герпеса и других ).

ПЦР — диагностика острых кишечных и респираторных инфекций.

Другие анализы методом ПЦР

Для данного анализа можно исследовать ряд других жидкостей организма: например, сок простаты, плевральную жидкость, спинномозговую, околоплодную, суставную, слюну и др..

  • Исследование практически не имеет отличий от анализа крови.
  • Происходит клонирование фрагментов нуклеиновых кислот различных возбудителей, методом полимеразной цепной реакции, ПЦР.
  •  На основе полученного результата специалисты делают вывод о наличии у человека какого-либо заболевания.

Полимеразная цепная реакция, анализ кала

Услышав жалобы на понос, рвоту, боли в животе, лечащий врач может направить клиента на сдачу ПЦР анализа кала.

  • На данный метод исследования затрачивается сравнительно небольшой промежуток времени.
  • Результаты пациент узнает уже через несколько часов.
  • Основными рекомендациями для получения достоверного результата является стерильность контейнера, в который будет помещен биологический материал,
  • а также исключение использования медикаментов, способных повлиять на работу кишечника или изменить окрашивание кала.

Проведение анализа мочи на ПЦР

  • Выявление инфекций, передающихся половым путем, чаще всего осуществляется посредством ПЦР исследования мочи.
  • Этот метод позволяет диагностировать, к примеру, вирус иммунодефицита человека, наличие в организме микроорганизмов рода Кандида.
  • Главным условием сдачи ПЦР анализа мочи является воздержание от половых контактов.
  • Женщинам также не следует сдавать мочу во время менструации.

Видео, ПЦР, полимеразная цепная реакция

Диагностика вирусных и бактериальных инфекций методом ПЦР

ПЦР диагностика позволяет выявить в организме наличие следующих инфекций:

  • Туберкулез;
  • вирус Эпштейна-Барра;
  • Токсоплазмоз;
  • Листериоз;
  • Опоясывающий лишай;
  • Цитомегаловирус;
  • Хламидиоз;
  • Клещевой энцефалит и многие другие;
  • При помощи ПЦР возможна диагностика вирусных гепатитов.
  • ВИЧ, вирус иммунодефицита человека, также может быть диагностирован посредством ПЦР теста.
  •  Данный метод обследования используется, например, для обнаружения ВИЧ у ребенка зараженной матери.

Высокая точность анализа ПЦР

Степень достоверности результата зачастую зависит от подготовки пациента.

  • Результат проведенного исследования всегда однозначен: либо отрицателен, либо положителен.
  • Но специалист не может поставить точный диагноз, руководствуясь только результатом теста ПЦР.
  • Он используется в качестве дополнительного обследования.
  • Для анализа крови методом ПЦР используется кровь, взятая из вены.

  • Причем, в случае, когда полимеразная цепная реакция проводится на ранних стадиях заболевания, есть вероятность ложноотрицательного результата.
  • Тогда необходимо повторное проведение процедуры через определенный период.

ПЦР анализ на ВИЧ и вирус герпеса

  • Методом ПЦР можно определить наличие ВИЧ-инфекции в организме.
  • Наличие ВИЧ — инфекции  также является одним из условий, при которых необходима сдача ПЦР анализа на вирус герпеса.
  • Обследование поможет обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту за небольшой промежуток времени.
  • Для проведения исследования дополнительно может использоваться такой биологический материал, как мазок из уретры.
  • Перед процедурой отбора пациенту следует воздержаться от мочеиспускания в течение нескольких часов.

Диагностика туберкулеза методом ПЦР

Туберкулез также можно выявить по результатам анализа крови методом ПЦР.

  • Лечащие врачи дают пациентам направление на данное обследование для уточнения диагноза в спорных случаях.

Когда показан анализ ПЦР при беременности

  • ПЦР анализ как метод, используемый для диагностики огромного количества болезней, является обязательным для женщины во время беременности.
  • Обследование проводится для того, чтобы понять, имеет ли место угроза для нормального развития плода.
  • Обследование такого рода может быть назначено как в виде плановой процедуры, так и в случае, когда имеется подозрение на наличие каких-либо заболеваний.
  • Специалист может по результатам полимеразной цепной реакции сделать вывод о развитии определенных патологий в организме беременной женщины, а также о риске заражения плода.

Видео, ПЦР анализ на инфекции, зачем сдавать

Подготовка к проведению ПЦР анализа

Для максимально точного результата исследования клиент должен подготовиться процедуре отбора биологического материала. Среди рекомендаций по подготовке к сдаче крови выделяют:

  • Исключение тяжелых физических нагрузок;
  • Употребление «правильной» пищи (отсутствие в рационе алкоголя и жирной пищи).

Для продуктивной сдачи мочи необходимо:

  • Использовать стерильный контейнер для переноса жидкости;
  • Отбирать биологический материал утром, сразу после пробуждения;
  • Воздержаться от половых связей за несколько дней до процедуры.

Подготовка к отбору мазка включает в себя:

  • Гигиену половых органов с помощью обычной проточной воды, при отсутствии ароматных моющих средств;
  • Воздержание от мочеиспускания за некоторое время до сдачи биологического материала.

Видео, полимеразная цепная реакция в картинках

Навигатор по сайту

Общий анализ крови

Анализы, которые покажут рак

Генетические анализы

Биохимические анализы, когда они нужны

Анализы на гормоны

ПЦР анализ самый точный на инфекции и на паразитов

Иммуноферментные анализы в диагностике 

analyzekrovi.ru

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - описание

Полимеразная цепная реакция, ПЦР (англ. — PCR — polymerase chain reaction) не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР — это метод, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (ДНК) инфекционного возбудителя и многократно размножить его.

В диагностике инфекций передаваемых половым путем (ИППП) также используются следующие методики:

  • микроскопия — исследование неокрашенных и окрашенных препаратов в светооптическом микроскопе. Точность метода зависит от опыта врача-лаборанта. Как правило хорошо диагностируются гонококки, трихомонады, гарднереллы и кандиды (бактерии больших размеров). Другие инфекции не видны под микроскопом, так как очень маленького размера.
  • бактериология — культивирование (выращивание) инфекций на питательных средах. До практического использования ПЦР, бактериальное исследование считалось «золотым стандартом» в диагностике ИППП, т. е. самым точным методом. Большим плюсом данной методики является возможность определения чувствительности микробов к антибиотикам. Минусом — необходимость быстрой доставки клинического материала в лабораторию, пока микробы не погибли в окружающей среде, не все ИППП растут на питательных средах, необходимость использования качественных питательных сред, сроки получения результатов — 5 — 7 дней.
  • иммуноферментный анализ — определение специфических антител (белков), вырабатываемых в ответ на внедрение микробов (антигенов) в сыворотке крови. То есть выявляют не сам микроб, а антитела которые вырабатывает организме человека. Плюсом метода является возможность определение стадии инфекционного процесса (в острой стадии определяются иммуноглобулины (антитела) класса М, в хронической — иммуноглобулины класса G). Минусом — отсутствие выработки антител у пациентов с иммунодефицитом, перекрестная реакция антител со схожими микробами, низкие показатели чувствительности и специфичности. На основании результатов только ИФА без подтверждения другими методами диагностики и при отсутствии клинических проявлений выставлять диагноз не представляется возможным.

В настоящее время ПЦР является самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний. Точность любого метода диагностики в медицине оценивается такими понятиями как чувствительность и специфичность.

 

Чувствительность — процент положительных результатов среди обследованных инфицированных лиц. Это значит, что при обследовании 100 человек больных хламидиозом методом ПЦР диагноз будет подтвержден у 98-99 человек, а у 1-2 человек из 100 будет установлен ложноотрицательный результат. Чувствительность ИФА в диагностике инфекций передаваемых половым путем — 50-60%. Это значит, что у 40-50 людей из 100 больных хламидиозом возможен ложноотрицательный результат.

Специфичность — процент отрицательных результатов среди обследованных здоровых лиц. Это значит , что при обследовании 100 здоровых людей на хламидии методом ПЦР у 97-98 обследуемых покажет отрицательный результат, а у 2-3 человек возможен ложноположительный результат. Специфичность ИФА составляет 60-70%. 

Ниже приведены показатели чувствительности и специфичности методов диагностики инфекций передаваемых половым путем.

Метод диагностики

Чувствительность, %

Специфичность, %

Микроскопия

20 — 60

70 — 80

Бактероилогия

40 — 80

80 — 90

ИФА -серология

50 — 60

60 — 70

ПЦР

98 — 99

97 — 98

Как видно из таблицы метод ПЦР обладает наилучшими результатами в диагностике инфекции передаваемых половым путем. Именно поэтому можно получить разные результаты исследования у одного человека, если он обследован разными методами диагностики. Но приоритет всегда должен отдаваться ПЦР, как самому точному из всех. 

На сегодняшний день существует 2 методики ПЦР-анализа: так называемая «форезная» и «ПЦР в реальном времени» (более современная).

Основным приемуществом методики ПЦР в реальном времени по сравнению с форезом является:

  • сведение к минимуму риска контаминации (загрязнение) лаборатории и связанных с ней ложно-положительных результатов и артефактов ПЦР-анализа
  • упрощение требований к организации лаборатории — отсутствует необходимость в изолированном дополнительном помещении для проведения этапа детекции и отдельного врача -лаборанта
  • автоматический анализ результатов с помощью компьютера, стандартизация результатов, исключение субъективности результатов (при форезной методике результат исследования определяется врачем-лаборантом, а при ПЦР в реальном времени — компьютером)
  • возможность количественной оценки содержания ДНК возбудителя в клиническом образце

Несмотря на высокую точность анализов, не редки случаи получения противоположных результатов в разных ПЦР-лабораториях. Это объясняется многими факторами. Критериями качественной работы лаборатории является:

  • использование сертифицированных тест — систем, обладающих высокой аналитической чувствительностью
  • использование внутренних и внешних контролей работы лаборатории
  • высокая воспроизводимость результатов (95 — 98%)
  • современное оборудование
  • квалифицированные специалисты
  • борьба с контаминацией (загрязнением лаборатории продуктами амплификации)
  • правильное расположение «рабочих» зон лаборатории
  • при наличии сомнительных результатов и артефактов ПЦР-анализа — их перестановка на различных этапах
  • архивирование результатов исследований с возможностью их просмотра в спорных случаях.

Таким образом, только сочетание грамотного специалиста и качественно работающей лаборатории могут обеспечить постановку правильного диагноза и как следствие быстрого и полного выздоровления. Если возникает несоответствие клинической картины с результатами лабораторных исследований, необходимо повторное проведение анализов. Единственное нужно понимать, что подтвердить диагноз, поставленный методом ПЦР, можно только методом ПЦР, выполненным в другой лаборатории или повторно в этой же, так как другие способы диагностики сильно уступают вышеуказанному методу диагностике.

avenumed.ru

ПЦР анализ

Название исследования Клинический материал Результат Срок испол. Цена
Хламидии
ДНК Chlamydia trachomatis соскоб урогенит. тракта, секрет простаты, сперма, моча, мазок с коньюнктивы, мазок из ротоглотки, синовиальная жидкость кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Chlamydia trachomatis соскоб урогенит. тракта,  моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 560,00р.
Микоплазмы
ДНК Mycoplasma hominis соскоб из урогенит. тракта секрет простаты, сперма, моча кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Mycoplasma hominis соскоб из урогенитального тракта кол. 3 р.д. 360,00р.
ДНК Mycoplasma genitalium соскоб урогенит. тракта, секрет простаты, сперма, моча кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Mycoplasma genitalium соскоб урогенит. тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 560,00р.
Уреаплазмы
ДНК U.urealyticum / U. parvum соскоб из урогенит. тракта, моча, секр. простаты, сперма кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК U.urealyticum / U. parvum соскоб урогенит. тракта кол. 3 р.д. 420,00р.
Гарднереллы
ДНК Gardnerella vaginalis соскоб из урогенит. тракта кач. 2 р.д. 190,00р.
Трепонемы
ДНК Treponema pallidum соскоб из урогенит. тракта, секрет простаты кач. 2 р.д. 190,00р.
Нейссерии
ДНК Neisseria gonorrhoeae соскоб из урогенит. тракта, моча, секрет простаты, сперма кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Neisseria gonorrhoeae соскоб из урогенитального тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 630,00р.
Микобактерии
ДНК Mycobacterium tuberculosis complex секрет простаты, сперма, моча, мокрота, СМЖ, БАЛ, ПЖ, синовиальная жидкость кач. 2 р.д. 290,00р.
Стрептококки группы А
ДНК Streptococcus pyogenes (Стрептококки группы А) мазок из ротоглотки кач. 2 р.д. 290,00р.
Стрептококки группы В
ДНК Streptococcus agalactia (SGB) соскоб из урогенитального тракта, моча кол. 2-3 р.д. 260,00р.
ДНК Streptococcus agalactia (SGB) кровь с ЭДТА кол. 3 р.д. 630,00р.
ДНК Streptococcus agalactia (SGB) мазок из ротоглотки, мокрота, БАЛ, СМЖ кол. 3 р.д. 630,00р.
Листерии
ДНК Listeria monocytogenes СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 420,00р.
ДНК Listeria monocytogenes кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 420,00р.
ДНК Listeria monocytogenes кал кач. 3 р.д. 440,00р.
ДНК Bordetella pertussis/parapertussis/bronchiseptica мазок из носа/зева, аспират, мокрота, БАЛ кач. 3 р.д. 1260,00р.
ДНК Campylobacter species кал кач. 4 р.д. 440,00р.
ДНК Salmonella species кал кач. 4 р.д. 440,00р.
ДНК Shigella + E. coli (энтероинвазивные штаммы) кал кач. 4 р.д. 760,00р.
ДНК Salmonella/Shigella / Campylobacter / Adenovirus кал кач. 3 р.д. 830,00р.
РНК Rotavirus / Astrovirus / Norovirus / Enterovirus кал кач. 3 р.д. 950,00р.
Диарогенные эшерихиозы кал кач. 3 р.д. 730,00р.
Кандида
ДНК Candida albicans соскоб из урогенит. тракта кач. 2 р.д. 190,00р.
Токсоплазма
ДНК Toxoplasma gondii СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 390,00р.
ДНК Toxoplasma gondii кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 390,00р.
Трихомонады
ДНК Trichomonas vaginalis соскоб из урогенит. тракта, секрет простаты, моча кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Trichomonas vaginalis соскоб из урогенит. тракта, моча, мазок из влагалища кол. 3 р.д. 390,00р.
Пневмоцисты
ДНК Pneumocystis jirovecii (carinni) мазок из ротоглотки, мокрота, БАЛ кач. 3 р.д. 320,00р.
Гепатит A
РНК HAV кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 440,00р.
Гепатит В
ДНК HBV биоптат кач. 7 р.д. 440,00р.
ДНК HBV кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 440,00р.
ДНК HBV кровь с ЭДТА кол. 7 р.д. 1420,00р.
ДНК HBV кровь с ЭДТА ген. 10 р.д 1160,00р.
ДНК вируса гепатита В (ДНК HBV), ультрачувствительный метод кровь с ЭДТА кач. 10 р.д 2100,00р.
Гепатит С
РНК HCV биоптат кач. 7 р.д. 440,00р.
РНК HCV кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 440,00р.
РНК HCV кровь с ЭДТА кол. 7 р.д. 1950,00р.
РНК HCV (типы 1,2,3) кровь с ЭДТА ген. 4 р.д 800,00р.
РНК HCV (типы 1а, 1b, 2, 3а, 4, 5, 6) кровь с ЭДТА ген. 10 р.д 1800,00р.
РНК вируса гепатита С (РНК HCV), ультрачувствительный метод кровь с ЭДТА кач. 10 р.д 1950,00р.
Гепатит D
РНК HDV биоптат кач. 7 р.д. 440,00р.
РНК HDV кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 440,00р.
Гепатит E
РНК HEV кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 780,00р.
Гепатит G
РНК HGV кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 440,00р.
Цитомегаловирус
ДНК Cytomegalovirus соскоб из урогенит. тракта, моча, мазок с коньюнктивы, мазок из ротоглотки, АЖ , СМЖ кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Cytomegalovirus кровь с ЭДТА кол 4 р.д. 410,00р.
ДНК Cytomegalovirus кровь с ЭДТА (плазма) кол 10 р.д. 830,00р.
Вирус простого герпеса
ДНК Human herpes virus 1, 2 типов соскоб урогенит. тракта, мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 190,00р.
ДНК Human herpes virus 1, 2 типов кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 360,00р.
Вирус герпеса VI типа
ДНК Human herpes virus 6 типа мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 320,00р.
ДНК Human herpes virus 6 типа кровь с ЭДТА кол 4 р.д. 340,00р.
Вирус Эпштейна-Барр
ДНК Epstein-Barr virus мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 370,00р.
ДНК Epstein-Barr virus кровь с ЭДТА кол 4 р.д. 410,00р.
Вирус Варицелла - Зостер
ДНК Varicella-Zoster virus мазок из ротоглотки, СМЖ, АЖ кач. 2 р.д. 360,00р.
ДНК Varicella-Zoster virus кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 360,00р.
Папилломавирус
ДНК ВПЧ 16 и 18 типов Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки - у женщин; уретра, крайняя плоть - у мужчин) кач. 3 р.д. 190,00р.
ДНК ВПЧ 6 и 11 типов Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки - у женщин; уретра, крайняя плоть - у мужчин) кач. 3 р.д. 190,00р.
Количество ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59,68 типы) Соскоб из урогенитального тракта женщин (цервикальный канал, шейка матки) кол. 5 р.д. 840,00р.
Количество ДНК ВПЧ 16 и 18 типов Соскоб из урогенитального тракта женщин (цервикальный канал, шейка матки) кол. 5 р.д. 440,00р.
ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59,68 типы) Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки - у женщин; уретра, крайняя плоть - у мужчин) кач. 3 р.д. 320,00р.
ДНК ВПЧ высокого риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56, 58,59 типы) Соскоб из урогенитального тракта (цервикальный канал, шейка матки - у женщин; уретра, крайняя плоть - у мужчин) ген. 5 р.д. 710,00р.
ВПЧ-тест расширенный (с определением кол-ва и типа вируса) Соскоб из цервикального канала комп. 3-7 р.д. 1260,00р.
ВПЧ-ПАП-тест (комплекс тестов ВЧП расширенный с определением кол-ва и типа вируса) Соскоб из цервикального канала (стекло + пробирка) комп. 3-7 р.д. 2840,00р.
ВПЧ-ПАП-тест жидкостный (комплекс тестов ВЧП расширенный с определением кол-ва и типа вируса и ПАП-тест) Соскоб из цервикального канала жидкостный комп. 3-7 р.д. 3360,00р.
ВПЧ-тест расширенный жидкостный (с определением кол-ва и типа вируса) Соскоб из цервикального канала жидкостный комп. 3-7 р.д. 1680,00р.
ПАП-тест жидкостный Соскоб из цервикального канала жидкостный   7 р.д. 2540,00р.
Энтеровирус
РНК Enterovirus СМЖ, мазок из ротоглотки кач. 3 р.д. 530,00р.
РНК Enterovirus кровь с ЭДТА кач. 4 р.д. 420,00р.
РНК Enterovirus кал кач. 4 р.д. 530,00р.
Аденовирус
РНК Adenovirus мазок из носа/зева, мазки с конъюнктивы, СМЖ кач. 3 р.д. 530,00р.
Вирусы гриппа А и В , парагриппа 1,2,3,4 типов
Вирус гриппа А и В (РНК Myxovirus influenza) отделяемое носоглотки кач. 2 р.д. 420,00р.
Вирус парагриппа 1,2,3,4 типов (РНК Parainfluenza virus 1,2,3,4) отделяемое носоглотки кач. 2 р.д. 480,00р.
РНК вирусов гриппа А и В, парагриппа 1,2,3,4 типов (РНК Myxovirus influenza, РНК Parainfluenza virus 1,2,3,4) отделяемое носоглотки кач. 2 р.д. 790,00р.
"Вирус гриппа А, А/h2N1/СА/2009, В" (свиной грипп) мазок из носа и зева кач. 2 р.д. 1160,00р.
Парвовирус В19
ДНК Parvovirus B 19 мазок из ротоглотки, слюна, АЖ кач. 3 р.д. 770,00р.
ДНК Parvovirus B 19 кровь с ЭДТА кол. 3 р.д. 420,00р.
ВИЧ (Вирус иммунодефицита человека)
ДНК HIV кровь с ЭДТА кач. 10 р.д. 1580,00р.
РНК HIV кровь с ЭДТА кол. 10 р.д. 4410,00р.
РНК/ДНК ВИЧ 1 типа, ультрачувствительный метод Очищенные сперматозоиды   10 р.д. 9450,00р.
Вирус краснухи
РНК вируса краснухи (Rubella virus) Кровь с ЭДТА кач. 3 р.д. 730,00р.
РНК вируса краснухи (Rubella virus) Мазок из ротоглотки, амниотическая жидкость (АЖ), спинномозговая жидкость (СМЖ, ликвор) кач. 3 р.д. 800,00р.
Респираторно-синцитиальный вирус
РНК респираторно-синцитиального вируса человека (hRSV) Мазок из носа/зева, аспират, мокрота,БАЛ кач. 2 р.д. 1260,00р.
КОМПЛЕКСНАЯ ДИАГНОСТИКА ОРВИ
Диагностика ОРВИ
РНК hRSv -  Respiratory Syncytial virus (респираторно-синцитиальный вирус человека)
РНК hMpv - Metapneumovirus (метапневмовирус человека)
РНК hСv- Coronavirus (коронавирус человека)
РНК hRv- Rhinovirus  (риновирус человека)
ДНК hAdv - Adenovirus B, C, E (аденовирус человека групп B, C и E)
ДНК hBv - Bocavirus (бокавирус человека)
РНК hPiv - Parainfluenza virus (вирус парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов)
Мазок из носа/зева, аспират, мокрота,БАЛ кач. 2 р.д. 1680,00р.

rammedic.ru

Инфекции, которые определяет пцр анализ. Их диагностика и расшифровка

В последние годы медицина и наука совместно прикладывают большое количество усилий для того, чтобы своевременно диагностировать инфекционные заболевания и начинать их лечение еще на ранних стадиях. Во многом помогает в этом метод полимеразной цепной реакции, которая также известна под сокращенным названием ПЦР.

Многие пациенты интересуются, в чем суть исследования, и какие инфекции с его помощью можно диагностировать. Какой биоматериал можно использовать, и как приготовиться к прохождению анализа?

Суть ПЦР-методики

Первоначально ПЦР разрабатывался, как методика научных исследований. Ее активно применяли в молекулярной биологии для исследования различных процессов, происходящих с живыми организмами.

Только спустя приличный промежуток времени реакцию цепной полимеризации стали применять в медицине, как полноценный способ диагностики. Сегодня с ее помощью можно не только выявить острое заболевание. Но и определить хронический процесс, диагностировать генетические патологии. И, что особенно важно, определить наличие инфекции еще до того, как у человека появятся ее первые симптомы. То есть ПЦР остается рабочим методом даже в том случае, если инфекция находится в периоде инкубации.

В основе лежат методы молекулярной биологии, так как анализ пришел именно из этой научной сферы. В биологический материал пациента добавляют специальные реагенты. Они вступают в реакции с ДНК или РНК возбудителя.

То, с чем реагент вступит в реакцию, зависит непосредственно от того, какой материал содержится в исследуемых жидкостях или тканях. После того, как реакция стартовала, начинается копирование выявленных частиц возбудителя. Проходит копирование в несколько этапов, чтобы процесс был более легким. Как только умножение выявленных патологических фрагментов подходит к концу, лаборант, следивший за ходом исследования, может сравнить полученные данные со специальной базой данных. Именно на этом этапе и опознается возбудитель, спровоцировавший патологические изменения в организме человека.

Список выявляемых инфекций

ПЦР инфекции, выявляемые с помощью исследования, очень многообразны. Список включает множество позиций. Причем есть возможность поставить диагноз не только бактериальной, но и вирусной или грибковой инфекции. В результате ценность ПЦР как способа диагностики только возрастает.

С помощью методики диагностируют следующие заболевания:

  • Вирус иммунодефицита человека

ПЦР исследование при подозрении на заражение человека ВИЧ-инфекцией является едва ли не золотым стандартом. С его помощью удается обнаружить в организме этот опасный вирус, который приводит к сильнейшим изменениям в иммунной системе.

Выявить герпес с помощью этого подхода можно не только в стадии обострения, но и во время ремиссии заболевания. Что гораздо важнее, как говорят врачи, появляется также возможность точно определить генотип патогена. А значит и подобрать правильное лечение.

  • Различные инфекции мочеполовых путей

В это группу входят гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз, трихомониаз и др. Список весьма обширен и включает в себя около 30 возбудителей. ПЦР методика постепенно вытесняет более классические методы, такие как микроскопия и посев. Объясняется это тем, что классические способы диагностики требуют большого количества времени. А оно может быть по-настоящему важным в лечении.

ПЦР на гепатиты позволило сделать настоящий прорыв в лечении этих опасных не только для здоровья, но и для жизни заболеваний. Сейчас без полимеразной реакции нельзя представить себе не только правильное определение вида вируса. Но и назначение адекватной терапии пациентам, столкнувшимся с этими вирусными болезнями.

  • Вирус папилломы человека

ВПЧ - еще один распространенный вирус, который диагностируется с помощью цепной полимеризации. Причем часто важно не просто определить наличие вируса, но и установить, что это за штамм. Исследование играет роль для представительниц прекрасного пола. Дело в том, что многие женщины страдают от ВПЧ, некоторые штаммы которого могут способствовать формированию рака шейки матки. Только своевременная диагностика и принятие мер помогут в этом случае избежать беды.

  • Цитомегаловирус

Цитомегаловирусная инфекция, как и ВПЧ, распространена довольно широко. Наибольшую угрозу она представляет для беременных женщин. Так как способствует рождению ребенка с различными дефектами, иногда вплоть до летального исхода. На цитомегаловирус и антитела к нему проверяют многих беременных представительниц прекрасного пола.

Полимеразная цепная реакция в диагностике этой болезни играет не последнюю роль.

Особенно важно это, учитывая тот факт, что туберкулез очень распространен. Он тяжело поддается лечению и часто характеризуется весьма скудной симптоматикой.

ПЦР чаще всего используют для того, чтобы подтвердить итоговый диагноз, который уже был заподозрен из-за положительной пробы манту. Естественно, список инфекционных болезней, выявляемых с помощью полимеразной реакции, далеко не полный. Доктор может назначать обследование и при подозрении на другие ЗППП или инфекционное поражение иных органов и тканей.

Какой биоматериал может использоваться

Как отмечают доктора, для подтверждения диагноза могут применяться самые разные биологические материалы.

Наиболее часто применяют:

  • Сыворотку или плазму крови, или саму кровь. В них выявляются ВИЧ, цитомегаловирус, все гепатиты, передаваемые половым путем, герпес. Также кровь берется в том случае, если необходимо определить генетические заболевания.
  • Соскобы с различных слизистых оболочек. Их особенно часто рекомендуют выполнять, например, при подозрении на заболевания, передающиеся половым путем. Эффективны соскобы со слизистых, если патогенные микроорганизмы поражают именно слизистые оболочки в первую очередь.
     

  • Различные биологические жидкости. Пациенту мужского пола может потребоваться сдать на анализ секрет простаты или сперму. Если речь о женщине, то у нее для исследования могут браться околоплодные воды во время беременности. У пациента любого пола берутся слюна, смыв с бронхов, суставная смазка и жидкость, находящаяся в спинном мозге.
  • Мокрота. Ее забирают для оценки в том случае, если подозревается легочная форма некоторых бактериальных заболеваний. Также ее обязательно исследуют при подозрении на туберкулезное поражение.
  • Моча. Ее исследование рекомендуется при многих урогенитальных исследованиях. У представителей сильного пола оценка мочи нередко может выступать вместо взятия соскоба с поверхности уретры, так как эта процедура травматична и весьма неприятна.
  • Биоптаты. Используются довольно редко. Их рекомендуют брать из желудка или двенадцатиперстной кишки в том случае, если у пациента есть подозрение на заражение хеликобактером.

Особенности подготовки к исследованию

Чтобы ПЦР анализ на инфекции оказался эффективным и достоверным, к его сдаче необходимо правильно подготовиться. Также рекомендуется соблюдать ряд правил при сдаче биоматериала, чтобы избежать столкновения с недостоверными результатами. Кровь всегда сдается по стандартной схеме.

Пациенту доктор советует прийти в больницу в утреннее время, на голодный желудок. Полученную кровь, плазму или сыворотку стараются в ближайшее время отправить в лабораторию.

Накануне исследования рекомендуется отказаться от слишком острых, соленых или жареных блюд, не пить алкоголь. Также пациентам рекомендуется избегать воздействия на организм стрессовых факторов. Чтобы сдать мочу, подготовка в принципе аналогична.

Дополнительно пациенту рекомендуется приобрести в аптеке специальный стерильный контейнер и наполнить его в соответствии с инструкцией, полученной от доктора. Использовать банки и другие нестерильные емкости для сдачи анализа нельзя!

Если емкость заполняется в домашних условиях, доставить ее больницу нужно максимум в течение двух часов. При этом нельзя допускать остывания емкости.

Соскоб со слизистых сдается всегда в условиях больницы. При этом как мужчинам, так и женщинам рекомендуется минимум на сутки отказаться от секса и не мочиться за 2-3 часа до сдачи анализа.

Важно помнить, что врач всегда даст подробную инструкцию относительно того, как правильно собирать материал для исследования. Если получить инструкцию от доктора не удалось, его всегда можно спросить, каких рекомендаций стоит придерживаться, чтобы результаты были достоверными.

Особенности расшифровки

Расшифровка результатов может показаться совсем простым делом. Ведь существует только два варианта ответа: положительный и отрицательный. Если результат отрицательный, значит человек, сдававший биологический материал, не заражен той инфекцией, проверку на которую он проходил. Если же результат положительный, значит инфекция присутствует в организме. И нужно как можно скорее начать терапию, чтобы с ней справиться.

Как отмечают доктора, расшифровка только кажется легким делом.

На самом же деле ее выполнение - дело непростое. Потому что необходимо учитывать хоть маленький, но риск ложноположительных и ложноотрицательных реакций. Только доктор, оценив симптомы болезни у конкретного пациента, его общее состояние и другие параметры, может сказать, насколько можно доверять полученным результатам. Если они оцениваются, как сомнительные, больного с большой долей вероятности отправят сдавать анализы повторно.

Точность методики

Многих пациентов интересует вопрос о том, насколько сильно можно доверять исследованию. Как отмечают врачи, это один из самых высокоточных методов диагностики различных инфекций, которые существуют на сегодняшний день. Его точность объясняется тем, что работа происходит с ДНК и РНК. А эти элементы строго индивидуальны для каждого вида патогенных микроорганизмов. Следовательно, риск ошибки сведен к минимуму.

Опираясь на полимеразную реакцию цепного типа, можно узнать:

  • есть в организме патогенные элементы, или они отсутствуют;
  • определить, что конкретно за инфекция стала причиной появления тех или иных симптомов;
  • поставить диагноз даже в том случае, если микробов или вирусов еще очень мало, и другими методами диагностики они не улавливаются.

Важно помнить, что даже ПЦР не дает 100% надежности. Существует риск столкновения с неверными результатами. И только врачебная оценка может помочь точно понять, стоит ли человеку начинать лечение. 

Преимущества и недостатки

Как и любой другой метод, ПЦР обладает своими преимуществами и недостатками. Преимуществ, как отмечают доктора, на сегодняшний день больше.

Среди них:

  • высокая чувствительность тестовых систем, позволяющая ставить диагнозы даже в сложных случаях, когда возбудитель еще находится в периоде инкубации;
  • высокая специфичность тестов, позволяющая точно понять, что за патоген стал причиной негативных процессов;
     

  • универсальность методики, заключающаяся в том, что с помощью одного метода можно без проблем провести исследование на разные микроорганизмы, используя один и тот же биоматериал;
  • быстрота исполнения, позволяющая получить результаты максимум через сутки после проведения анализа, а иногда и значительно быстрее;
  • возможность обследоваться на заражение сразу несколькими инфекционными заболеваниями без необходимости сдавать множество разных биологических материалов.

Несмотря на большое количество преимуществ, недостатки у ПЦР-метода также имеются. Во-первых, требуется хорошее техническое оснащение лаборатории. Во-вторых, лаборант должен быть хорошо обучен и обладать специфическими знаниями, чтобы не допустить ошибок в технологии. Если два этих условия соблюдаются, реакция цепной полимеризации становится эффективным способом постановки диагнозов!

www.venerologia.ru

Результаты ПЦР: расшифровка и интерпретация.

Результаты ПЦР и особенности их расшифровки интересуют многих людей, чьим диагнозом является подозрение на ЗППП.

Как отмечают доктора, метод обладает высокой результативностью и минимальным процентом ошибок. Поэтому зачастую используется как контрольный в диагностике инфекционных процессов.

В чем состоит суть ПЦР методики, хотят знать больные люди, и благодаря чему обеспечивается высокая вероятность получения верных результатов. Как расшифровываются полученные итоги, и есть ли связь между этим методом и другими способами диагностики?

Содержание статьи

  • Суть метода ПЦР
  • Какие материалы можно использовать для ПЦР
  • Что значит положительный результат ПЦР
  • Что значит отрицательный результат ПЦР
  • Кто из докторов выполняет расшифровку результатов ПЦР
  • Когда показатели ПЦР становятся положительными после заражения
  • Вид бланка анализов на ПЦР
  • Вероятность ошибочных итогов при ПЦР
  • Связь ПЦР с другими методиками

Суть метода ПЦР

ПЦР-методика – исследование, используемое довольно широко в современном мире. Диагностика позволяет поставить диагноз не только при инфекционных процессах, но и при генетических патологиях, некоторых онкологических недугах. Изначально ПЦР изобреталась не для применения в медицине.

В отрасль здравоохранения метод пришел из области молекулярной биологии, в которой активно использовался после своего открытия. Ученый, создавший ПЦР, получил нобелевскую премию.

Прежде чем разбираться, как расшифровывать результаты анализов ПЦР, необходимо понять, в чем основная суть методики.

На самом деле на словах все выглядит довольно просто. У пациента берется биологический материал. Затем он обрабатывается особым образом с помощью специальных химических реагентов.

Затем получившуюся смесь помещают в особую машину, которая проводит процесс амплификации. То есть многократного умножения определенных фрагментов ДНК или РНК, что удалось выявить с помощью добавления реагентов.

Когда процесс амплификации подойдет к концу, доктору остается только идентифицировать полученные результаты, чтобы поставить верный диагноз.

Главное – проявить внимательность на этапе идентификации. Но учитывая, что сегодня большую часть работы делает компьютер, все сильно упрощается.

ПЦР отличается высокой эффективностью. Ее широко применяют для того, чтобы определять наличие в организме скрытых инфекционных процессов, которые не дают положительных серологических реакций. Также скрытые инфекции обычно нельзя выявить с помощью посева или микроскопии. Поэтому зачастую ПЦР – единственный достоверный способ постановки диагноза в этом случае.

Какие материалы можно использовать для ПЦР

Часто удачность исследования зависит от того, как и какой материал брался для выполнения анализа. Однако в случае с полимеразной цепной реакцией расшифровка результатов ПЦР исследований мало зависит от биологического материала, который брался у пациента. Гораздо большее значение имеет подготовка к обследованию с помощью метода.

В качестве материала могут служить:

  • кровь, сдаваемая в соответствии со стандартными рекомендациями из вены на локтевом сгибе
  • мокрота, собираемая при откашливании
  • налет с ротовой полости, собираемый доктором в утреннее время, пока пациент еще не завтракал и не чистил зубы
  • мазок с половых органов, дающий хорошие результаты в том случае, если больной не мочился в течение нескольких часов, отказывался от сексуальных контактов несколько дней и соблюдал ряд других рекомендаций
  • исследование мочи, при котором биоматериал также предпочтительно собирать с утра, не проводя накануне гигиену половых органов
  • биоптаты органов или тканей, получаемые с помощью специальных инструментов и др.

Как отмечают врачи, материалом для ПЦР может быть совершенно любая жидкая среда организма человека.

При выборе главное помнить о том, что предпочтение отдают той среде, где с большей долей вероятности будет присутствовать возбудитель. Например, при половых инфекциях целесообразнее брать мазок с половых органов или кровь, чем мазок из ротовой полости.

Решать вопрос о том, какие материалы используются для получения результатов ПЦР в том или ином случае, лучше всего с лечащим врачом на приеме. Доктор сделает оптимальный выбор, исходя из предполагаемого у пациента заболевания.

Что значит положительный результат ПЦР

ПЦР – метод, который может похвастаться своей высокой специфичностью.

Предположим, доктор поставил себе цель обнаружить какой-то патогенный микроорганизм в теле пациента. И если тот на самом деле присутствует в теле, он будет обнаружен. При этом спутать его с каким-либо другим патогеном благодаря уникальному коду ДНК будет невозможно.

Если ПЦР положительный, значит, в организме с вероятностью почти в 100% находится возбудитель, поиск которого проводился врачом. Ведь методика рассчитана, в отличие от многих других диагностических методов, именно на поиск самих возбудителей, а не их следов.

Как отмечают доктора, при данном исследовании вероятность случайно принять один возбудитель за другой сводится к нулю. Зато существует вероятность получения положительных результатов после терапии.

Если в организме будут оставаться обломки нуклеиновых кислот. Однозначно положительной реакция чаще всего бывает, если пациент предъявляет жалобы на какие-то конкретные симптомы инфекционного процесса. Причем результат будет сохраняться даже в течение нескольких месяцев после того, как возбудитель будет полностью побежден и удален из организма.

Что значит отрицательный результат ПЦР

Если ПЦР результат отрицательный, значительное число пациентов автоматически считают, что они здоровы. Это практически правильное решение.

Ведь если итоги оказались отрицательными, значит фрагменты патогенного микроорганизма не были определены тест-системой. Из этого следует логичный вывод, что микроорганизма в теле нет.

Однако стоит учитывать, что несмотря на всю свою высокую чувствительность и специфичность, методика имеет определенный порог чувствительности. Если концентрация возбудителя на момент обследования не переходит границу этого порога, результат будет расцениваться, как отрицательные. Хотя на самом деле окажется ложным до поры до времени.

Доктора акцентируют особое внимание на том, что отрицательный результат не всегда означает отсутствие патологии. Чтобы на 100% быть уверенным в своем здоровье, пройти исследование повторно рекомендуется через несколько недель, а порой и месяцев.

Кто из докторов выполняет расшифровку результатов ПЦР

Часто среди пациентов звучит вопрос о том, какой врач будет проводить расшифровку ПЦР исследования.

В первую очередь необходимо запомнить, что доверять результаты стоит тому же медицинскому работнику, что первоначально давал направление на исследование. Связана эта рекомендация с тем, что в этом случае доктор будет представлять себе, что он ожидает увидеть в анализах. Сможет грамотно интерпретировать итоги, соотнося их с клинической картиной.

Получить направление наиболее часто можно от уролога, гинеколога или венеролога. Соответственно, после получения итогов относить бланк с результатами стоит кому-то из них. Важно помнить, что ПЦР – довольно дорогой метод диагностики. Его не принято использовать просто так, без специальных показаний к обследованию.

Среди них:

  • появление специфических для ЗППП симптомов
  • обследование перед планированием беременности или процедурой искусственного оплодотворения
  • поиск причин бесплодия и другие показания

Когда показатели ПЦР становятся положительными после заражения

Часто пациенты задают на приеме у медицинского работника вопрос о том, когда результаты ПЦР крови и мазков становятся положительными после заражения. Все зависит от того, насколько быстро конкретная инфекция сможет, размножаясь, пройти пороговую для теста концентрацию в материале.

Преимуществом ПЦР является то, что порог чувствительности у теста довольно низкий. Это значит, что выявить признаки заражения можно даже в том случае, если количество возбудителя в биологическом материале будет минимальным.

Подобная особенность дает возможность постановки диагноза даже в период инкубации, когда симптомы еще полностью отсутствуют.

Однако осечка возможна и при применении ПЦР методики. Это происходит, например, если пороговая концентрация все же не успела достичь определяемых тестом значений. В этом случае велика вероятность получения далеких от правды результатов.

Вид бланка анализов на ПЦР

Вопрос о том, как выглядит бланк результатов анализов ПЦР, весьма актуален.

Как отмечают доктора, ничего сложного во внешнем виде бумаги нет. Зачастую на документе можно обнаружить название искомого возбудителя. А напротив него пометку «обнаружен» или «не обнаружен».

В первом случае пациенту рекомендуется озаботиться собственным здоровьем. Так как анализ расценивается как положительный, а человек, как зараженный. Следовательно, ему требуется терапия.

Во втором случае чаще всего состояние пациента оценивают, как здоровое, хотя могут быть и исключения. Важно помнить, что количество возбудителей, указанных на бланке, зависит во многом от того, какое конкретно вид анализа применялся.

Если проводился поиск только одного патогенного микроорганизма, в результате будет фигурировать только его название с соответствующей пометкой. Если ПЦР проводилось сразу на несколько инфекций, что тоже возможно, в бланке будет список патологий с пометками.

Сегодня в лабораториях при комплексном анализе на группу инфекций не принято выдавать на каждый патогенный микроорганизм отдельный бланк. Их все указывают на одном листе.

Вероятность ошибочных итогов при ПЦР

Часто пациенты интересуются вопросом о том, возможно ли получение ложных результатов обследования при использовании методики. К сожалению, как отмечают врачи, ошибки хоть и редко, но случаются.

Существует, например, вероятность получить ложноположительные результаты ПЦР сразу после лечения. Объясняется это очень просто.

Терапия уже окончена, возбудитель удален из организма и не может заражать новые ткани. Однако остатки ДНК или РНК еще могут циркулировать в крови или ином диагностическом материале. В этом случае тест-система будет улавливать их и воспринимать за полноценную патологию, выдавая ложноположительный итог.

Именно поэтому рекомендуется после терапии сдавать исследование несколько раз с разными промежутками времени. Только в этом случае итоги будут достаточно объективными.

Ложноотрицательные результаты анализов ПЦР после приема антибиотиков также возможны. Происходит это в том случае, если пациент, неверно используя препараты антибактериального ряда, смазал симптомы болезни.

Не позволил микроорганизму активно размножаться в теле, но при этом и не довел его уничтожение до конца. В этом случае количество возбудителей может упасть ниже пороговой концентрации чувствительности. Это и даст неверные результаты тестирования.

Связь ПЦР с другими методиками

С помощью метода ПЦР доктора нередко подтверждают или, напротив, опровергают результаты других методов обследования, используемых для диагностики ИППП.

Например, с этой целью может использоваться ИФА.

Бывает так, что ПЦР отрицательный, а ИФА положительный. Тогда больной оказывается в замешательстве относительно своего состояния.

Доктора рекомендуют не теряться, а сначала провести оба теста повторно. Если ИФА останется положительным, а ПЦР отрицательным, с большой вероятностью заболевание в организме пациента отсутствует.

Ведь иммуноферментный анализ направлен на реакцию антиген-антитело. И порой может принимать сходные по структуре антигены других возбудителей за искомый, выдавая ложноположительные результаты.

Вероятность того, что ИФА дало верный результате на второй раз, а ПЦР, напротив, выдало ошибку, например, из-за низкого титра возбудителя, сведена к минимуму. Это скорее казуистика, чем реальная клиническая практика.

Результаты ПЦР диагностики обладают высокой ценностью в диагностике большого количества различных патологий. В первую очередь методика является незаменимой при подозрении на различные ЗППП.

Если вам нужно сдать получить комментарии по результатам ПЦР, обращайтесь к автору этой статьи – венерологу в Москве с многолетним опытом работы.

onvenerolog.ru

ПЦР-диагностика. Что это?

ПЦР-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования,широко применяющийся в диагностике инфекционных заболеваний. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики.На базе клинической лаборатории создана ПЦР- лаборатория. ПЦР (полимеразная цепная реакция) -метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций "золотым стандартом". Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллиона других молекул. В настоящее время этот один из наиболее современных и совершенных лабораторных методов диагностики с успехом применяется при исследованиях специалистами клинической лаборатории СПбГУЗ"ГСПК".

ПЦР — (Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) - расшифровывается как полимеразная цепная реакция.

ПЦР диагностика — это метод лабораторной диагностики инфекционных заболеваний, в частности, этот метод широко применяется и для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции. «Небольшой фрагмент ДНК» — это несколько сотен пар оснований ДНК , расположенных в строго определенной последовательности.Для ПЦР-диагностики инфекций достаточно небольшого фрагмента, поскольку любая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований.При проведении ПЦР-анализа ведется поиск такого фрагмента ДНК инфекции, который специфичен только для данного микроорганизма. Это значит, что этот фрагмент ДНК «особенный» — он встречается только у этого микроба (или группы родственных микробов), но не встречается ни у одного другого микроба.Сама полимеразная цепная реакция (пцр диагностика) используется для того, чтобы найденный фрагмент размножить, клонировать: чтобы однозначно «увидеть» эти фрагменты ДНК, к окончанию реакции их должно быть не мене 1012 штук.

 История открытия ДНК и разработки метода ПЦР

Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.Появлению метода проведения полимеразной цепной реакции предшествовали определенные достижения молекулярной генетики: к тому времени уже были расшифрованы нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов и выделены специфические.Также появлению ПЦР много способствовало открытие уникального фермента ДНК-полимеразы (или taq-полимеразы). Именно этот фермент катализирует и «контролирует» все процессы во время проведения анализа методом ПЦР. Особенность этого фермента — он термостабилен, исключительно термостоек: он выдерживает нагревание до температуры кипения без потери активности, а «любимый» его температурный режим во время работы — 72оС. Многие реакции при проведении ПЦР идут почти исключительно при повышенной температуре.

В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов — возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

 Ежегодно появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей   различных заболеваний, так и мутаций генов человека.Официальное становление метода ПЦР в России связано с выходом в 1995 г. двух методических рекомендаций: "Диагностика хламидийной, микоплазменной и герпесвирусной инфекций методом цепной полимеразной реакции", в них ПЦР впервые рекомендована к применению в практическом здравоохранении; "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции". В 1995 г. была впервые подготовлена техническая документация (инструкции, технические условии.) и зарегистрирован в Минздраве России отечественной набор реагентов для ПЦР-диагностики. За прошедшие годы появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: мультипраймерная ПЦР, гнездовая ПЦР, ПЦР in situ, ПЦР в режиме реального времени . Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность и специфичность.  

 Изучение ДНК: строение, структура ДНК

 Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - универсальный носитель генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов. Открытие ДНК молекулы произошло в 1953 году. Френсис Крик и Джеймс Уотсон открыли структуру двойной спирали ДНК, их работа впоследствии была отмечена Нобелевской премией.ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из из последовательно соединенных нуклеотидов. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться (реплицироваться).В построении новой цепи активным "строителем" выступает специальный фермент - ДНК-полимераза.  Из одной молекулы ДНК образуются две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная. В основе анализа методом ПЦР лежит принцип репликации ДНК - синтеза ДНК, который современным ученым удалось воссоздать искусственно: в лаборатории врачи вызывают удвоение небольшого фрагментаДНК.   Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, другие биологические выделения, биоптаты.Забор материала производится в условиях процедурного кабинета лаборатории соответствующего профиля. После забора пробы вскоре должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию \ Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. \ В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее - природой его клеточной стенки.  Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др.  Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена.

 Количественная оценка результатов ПЦР

В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В ,С, вирус иммунодефицита человека Все большее развитие получает лабораторная диагностика на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) благодаря своей скорости и высокой чувствительности.

Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний:

 Прямое определение наличия возбудителей.

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

 Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток).

 .Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

 Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР- анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-5 часов 6.Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитарных агентов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды.В настоящее время метод ПЦР-диагностики интенсивно развивается.  Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа.Диагностика инфекционных заболеваний является наиболее частым приложением ПЦР в  медицинских учреждениях. Наиболее востребована ПЦР-диагностика вирусов (главным образом, вирусов гепатитов В и С, а также группы герпеса), а также возбудителей скрытых инфекций, передающихся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.).

 ПЦР в диагностике инфекционных болезней

Определить этиологию инфекции (т.е. какой именно микроорганизм или их сочетание вызвали воспалительный процесс). Для некоторых возбудителей, например,Mycoplazma genitalium, ПЦР – это единственный метод диагностики на сегодняшний день.Определить количество возбудителя. Особенно это актуально для условно-патогенных микроорганизмов,которые вызывают патологию только при определенных условиях (например, при повышении концентрации).Осуществить контроль за течением инфекционного процесса и оценить эффективность лечения. Однако необходимо учитывать тот факт, что ПЦР может улавливать даже единичные фрагменты ДНК, которые могут оставаться некоторое время после лечения, в связи с чем, контроль эффективности проводимой терапии рекомендуется проводить не ранее чем через 2-3 недели после ее окончания.Благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР позволяет выявлять возбудителя даже при минимальном его содержании. Особенно это актуально при бессимптомном течении инфекционного процесса, вызванного безусловно-патогенными микроорганизмами. 

 ПЦР в диагностике гепатитов.

В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В, С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких агентов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вышеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют разные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.

Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом  В крови больного гепатитом А вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е. возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается вышеуказанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови)

Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:

Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выраженными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учитывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса (85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным, насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:

Установить факт инфицированности гепатитом С. Это важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в крови больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляются как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серологического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» результаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекомендуется подтверждать качественным обнаружением РНК , и в зависимости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а также выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают количественное определение уровня РНК ВГС(при низкой вирусной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа ВГС. Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так, наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель, но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводимой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12 неделе лечения.Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обнаружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72 недели после окончания лечения.

Диагностика вирусных гепатитов

 Гепатит А вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита А (HAV)

 В крови для диагностики определяют:

 anti-HAV-IgM - aнтитела к вирусу гепатита А класса IgM – маркер острой инфекции вирусом гепатита А

 anti-HAV-total - aнтитела к вирусу гепатита А суммарные классов IgM и IgG

 Гепатит В вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита В 

В крови для диагностики определяют:HВsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В – основной маркер вирусного гепатита В или вирусоносительства;HBeAg - Hbe антиген вируса гепатита В – маркер активной репликации (размножения) вируса в органинизме;Anti-HBs - антитела к HBs антигену вируса гепатита В – маркер защитного иммунитета против вируса гепатита В, определяются также после вакцинации;  Anti-HBc-total - антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В суммарные классов IgM и IgG – маркер перенесенного или текущего гепатита В;Anti-HBc IgM - антитела к сердцевинному антигену вируса гепатита В класса IgM – маркер острого процесса; Anti-HВe - антитела к Hbeантигену вируса гепатита В – маркер перенесенного острого гепатита В, маркер ремиссии; ДНК вируса гепатита В качественное и количественное определение методом ПЦР 

 Гепатит С вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита С (HСV)

В крови для диагностики определяют 

anti-HСV-total - aнтитела к вирусу гепатита С суммарные классов IgM и IgG – маркер инфицирования вирусом гепатита С (перенесенного или текущего)

РНК вируса гепатита С качественное и количественное определение методом ПЦР

Генотипирование вируса гепатита С – для определения тактики и эффективности лечения, прогноза на будущее

 Гепатит D вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита D (HDV)

 Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.

Гепатит G вызывается РНК-содержащим вирусом гепатита G (HGV)

Для диагностики применяется качественное определение РНК вируса методом ПЦР в крови.

 Гепатит TT вызывается ДНК-содержащим вирусом гепатита TT (TTvirus)

 Для диагностики применяется качественное определение ДНК вируса методом ПЦР в крови.

 ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции.

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход - обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) –anti-HIV  с последующим подтверждением положительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эффективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для проведения ИФА и ИБ Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь косвенным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некоторых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев). Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрицательным результатам ИФА и ИБ.Практически все тест-системы для ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явление присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех положительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начинают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использованием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного сомнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в течение 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для лиц, находящихся под таким наблюдением.Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практически до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут обнаруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1 года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диагноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблюдением до 36 мес.Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.

vitalab99.ru

Полимеразная цепная реакция

Генетика бактерий. Информация для второго занятия.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производится смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

  1. Выделенную ДНК из исследуемого образца,

  2. Буферный раствор,

  3. Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

  4. Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

  5. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

  6. Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus ).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

  1. Денатурация (температура 94оС) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

  2. Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60оС) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

  3. Элонгация (температура обычно 72оС) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР и описана в разделе «Разновидности ПЦР».

Динамика ПЦР

На ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных молекул ДНК, размер которых определяется расстоянием между местами посадки праймеров, удваивается с каждым циклом. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь (см. Рис 2).

Таким образом, на ранних циклах количество продукта ПЦР описывается формулой m*2n, где m – исходное количество искомой ДНК в пробе, n – число циклов. Затем реакция выходит на плато. Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата (см. Рис 3).

Разновидности ПЦР

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии - чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы (см. Рис. 4).

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции (см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения (см. Рис 5).Детекцияфлуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2.Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

в

б

а

Рисунок 3.Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе. (а) – наибольшая концентрация (б) – промежуточная концентрация (в) – наименьшая концентрация

K+

1

2

3

4

5

6

7

K-

Рисунок 4.Агарозный электрофорез продуктов ПЦР. К+ – положительный контроль (заведомо присутствует искомая ДНК). 1-7 – исследуемые образцы (из них 1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные). K- –отрицательный контроль (заведомо отсутствует искомая ДНК). Во многих случаях помимо целевого продукта видны более легкие неспецифические продукты реакции (праймер-димеры).

Рисунок 5. Способы детекции при использовании ПЦР в реальном времени. (а) – интеркалирующий краситель – флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК (б) – зонд Taqman – флуоресценция возникает при расщеплении зонда ДНК полимеразой с 5’-3’ эндонуклеазной активностью за счет разделения флуорофора и гасителя. (в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценция возникает при гибридизации зонда с целевым фрагментом за счет пространственного отдаления флуорофора и гасителя (г) – зонды LightCycler - флуоресценция акцептора возникает при гибридизации зондов (содержащих акцептор и донор) с целевым фрагментом за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

studfile.net


Смотрите также

Женские новости :)