Наша рассылка!
Новости сайта Модно-Красиво.ру Вы можете получать прямо на мейл
Рассылки Subscribe.Ru

Подписаться письмом

Кровь с эдта что это


Анализ на LE-клетки (кровь с ЭДТА): показания, методика, расшифровка результатов.


Аутоиммунные антитела: LE-клетки (кровь с ЭДТА)



Анализ, направленный на выявление в крови так называемых LE-клеток, иначе клеток системной красной волчанки (СКВ), волчаночных клеток, является одним из тестов лабораторной диагностики данного заболевания.

LE-клетки являются морфологическими маркерами системного аутоиммунного заболевания, СКВ. Представляют собой нейрофильные лейкоциты со специфической морфологией, выражающейся в наличии фагоцитированных фрагментов ядер клеток в виде бесструктурного гомогенного образования и ядра собственно нейрофила, смещенного к периферии и имеющего очертания полумесяца.

Формирование подобных клеточных структур является результатом иммунологических событий, характерных для системной красной волчанке, происходит в присутствии в плазме крови особой фракции иммуноглобулинов, LE-фактора, обладающей антинуклеарной активностью.

Факт обнаружения волчаночных клеток в крови свидетельствует о наличии в плазме антинуклеарных антител, что, в свою очередь, является показателем аутоиммунного характера заболевания.

LE-клетки выявляются в 40-90% случаев СКВ и существенно реже (не более 10%) при иных заболеваниях аутоиммунной природы, как в крови, так и в плевральных, перикардиальных, перитонеальных выпотах, в спинномозговой жидкости.

Характерно появление волчаночных клеток в крови пациентов на ранних стадиях заболевания, а также в период, когда имеет место обострение, число их зависит от степени выраженности заболевания.

Прием лекарственных препаратов может приводить к снижению числа выявляемых в плазме крови LE-клеток вплоть до полного их исчезновения.


Показания для прохождения анализа


Анализ по выявлению в крови LE-клеток предназначен:
  1. для лабораторной диагностики системной красной волчанки;
  2. для оценки эффективности выбранного курса лечения.

Методика проведения анализа

Суть анализа заключается в выявлении волчаночных клеток в мазке крови пациента с помощью микроскопического исследования.

В качестве материала для исследования используют  венозную кровь, взятую у пациента утром на голодный желудок и помещенную в пробирку с ЭДТА в качестве антикоагулянта, до начала курса лекарственной терапии.

Проводится данный анализ с использованием метода Цинкхома-Конли, модифицированном Е.Н.Новоселовой. Методика включает помещение свежезабранной крови пациента в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. В результате целого ряда манипуляций, включающих инкубацию клеток крови, механическое воздействие на них, способствующее образованию LE-клеток, центрифугирование, происходит выделение лейкоцитарной массы, из которой получают препараты. Они подвергают фиксации и окрашиванию гематологическими красителями. Метод достаточно трудоемкий, имеет определенный порог чувствительности, специфичности, воспроизводимости.


Результаты исследования и их интерпретация


Отсутствие на препаратах крови LE-клеток соответствует норме.

Выявление волчаночных клеток свидетельствует о наличии заболеваний аутоиммунной природы:

  • системная красная волчанка - от единичных клеток, умеренного их количества, большого количества в зависимости от степени заболевания;
  • системная склеродермия, смешанные заболевания соединительной ткани, хронический гепатит в активной стадии, дерматомиозит, ревматоидный артрит - в небольших количествах, непостоянно.
Исследование на факт присутствия или отсутствия в крови клеток LE - один из диагностических анализов на системную красную волчанку, который проводится в сочетании с другими специфическими анализами.

medcentr-endomedlab.ru

Клинический анализ крови

Клинический анализ крови включает определение :

-  гемоглобина

-   эритроцитов

-   лейкоцитов

-   подсчет лейкоцитарной формулы

-   определение скорости оседания эритроцитов

-   тромбоцитов.

Лабораторные методы исследования крови

Обеспечение высокого качества гематологических исследований возможно при стандартизации преаналитического и аналитического этапов работы.

Преаналитические ошибки   68,2%

Аналитические ошибки          13,3%

Постаналитические ошибки   18,5%

Факторы влияющие на показатели крови

-  физическая и эмоциональная нагрузка

-   сезонные, климатические, метеорологические условия

-   время суток

-   прием пищи

-   курение и т.д. 

-   возраст

-   пол

-   активность пациента и положение его тела в момент взятия крови.

     Показатели гемоглобина и гематокрита у больных в положении лежа снижены примерно на 6%. Выраженная диарея и рвота могут приводить к значительной дегидратации и гемоконцентрации.

Влияние суточных биоритмов на показатели крови

-  костный мозг наиболее активен утром

-   селезенка и лимфоузлы около 17 – 20 часов

-  максимум гемоглобина в крови наблюдается с 11 до 13 часов, а минимум с 16 до 18 часов;

-   эозинофилы наиболее низкие утром между 9 и 11 часами, пик эозинофилов наступает к 3 часам утра.

Исследования крови необходимо производить (кроме экстренных случаев) в одно и тоже время для получения сопоставимых результатов

Взятие и подготовка материала для исследования:

Взятие крови

-  На точность и правильность результатов оказывают влияние техника взятия крови, используемые при этом инструменты (иглы, скарификаторы и др.), пробирки, в которые осуществляется взятие, а в последующем происходит хранение и транспортировка.

-  Стандартизация преаналитического этапа за счет использования стандартизированных коммерческих расходных материалов для взятия, хранения и транспортировки биопроб, стандартных реактивов и диагностических систем позволяют существенно повысить достоверность и точность исследования.

Кровь для общего клинического анализа  берут:

-  из вены

-   из пальца

-   мочки уха

-   у новорожденных - из пятки

Исследование крови рекомендуется проводить утром натощак, до физической нагрузки и различных диагностических процедур, приема лекарственных препаратов, особенно вводимых парентерально.

Венозная кровь:

-  Оптимальным способом аспирации крови являются вакутейнеры (вакуумные системы взятия крови - Terumo, B&D):

- содержат определенное строго дозированное количество антикоагулянта и обеспечивают стандартные условия аспирации всего объема крови

- быстрое и качественное взятие крови пациента

- сокращение времени взятия крови на 30 – 50%

- кровь в пробирке не подвергается гемолизу

- одной венопункции достаточно для отбора крови в несколько пробирок

- отсутствует непосредственный контакт медицинской сестры или лаборанта с кровью больного, что обеспечивает профилактику вирусных инфекций, передающихся парентеральным путем.

Взятие крови шприцом без антикоагулянта с последующим переливанием в пробирку недопустимо:

-   контакт крови со стенками шприца ведет к образованию агрегатов тромбоцитов

-   трудно соблюсти точное соотношение кровь/антикоагулянт

-   давление в игле увеличивает вероятность гемолиза и разбрызгивания крови

-   нарушение целостности и стерильности пробы

-  - вероятность инфицирования персонала

Капиллярная кровь:

Для гематологических исследований капиллярную кровь рекомендуется брать в следующих случаях:

- при ожогах

- мелкие или труднодоступные вены

- выраженное ожирение

- склонность к венозному тромбозу

- у новорожденных

-  После прокола пальца несколько капель крови (не менее 3-4) спускают на индивидуальное предметное (часовое) стекло или гнездо пластикового планшета, перемешивают и используют для работы.

-   Кровь набирают индивидуальным, стерильным капилляром Панченко, предварительно смоченным цитратом натрия.

 После прокола кожи пальца, 6-8 капель крови спускают в пластиковую пробирку с антикоагулянтом К2ЭДТА или К3ЭДТА (трилон Б) из расчета 1,5-2,2 мг на 1 мл крови, либо в
специальные пластиковые пробирки одноразового пользования, обработанных К2ЭДТА (фир­ма "De-ta-ab", "Sarstedt" , "Becton Dickinson" и др.). Сразу же после взятия пробу необходимо тщательно перемешать, перевернув пробирку крышкой вниз не менее 10 раз.

Антикоагулянт:

-  К2ЭДТА или К3ЭДТА (дву- или трикалиевый этилендиаминтетраацетат или трилон Б)

-   тринатрий-цитрат

-   гепарин

ЭДТА - предпочтительный антикоагулянт при подсчете форменных элементов крови с использованием автоматических гематологических анализаторов. Концентрация ЭДТА во взятой крови должна быть постоянной и составлять 1,5 - 2,2 мг/мл крови (например, для получения соотношения 1,5 мг/мл в пробирку, рассчитанную на 2 мл крови, наливают 0,04 мл 7,5% раствора К2ЭДТА или К3ЭДТА). Недостаток антикоагулянта приводит к микросвертыванию крови и образованию сгустка, избыток - является причиной роста осмотического давления крови и сморщиваня клеток. У некоторых пациентов может наблюдаться небольшая спонтанная агрегация тромбоцитов или реже, так называемая, ЭДТА-зависимая псевдотромбоцитопения (иммунного характера). Использование Nа2ЭДТА не рекомендуется  вследствие его плохой растворимости в крови.

Гепарин - лучший антикоагулянт для определения осмотической резистентности эритроцитов и функциональных исследований лейкоцитов, включая ряд тестов с иммунологическими маркерами. Особенностью действия этого антикоагулянта является способность максимально предотвращать гемолиз. Мазки, приготовленные из гепаринизированной крови и окрашенные по Романовскому, имеют голубоватый фон.

Цитрат натрия - антикоагулянт выбора при исследованиях свертывающей системы крови и функции тромбоцитов.

Применение в качестве антикоагулянтов гепарина или цитрата натрия сопровождается изменениями в структуре клеток и поэтому не рекомендуется для исследования морфологии клеток крови, кроме того, гепарин не предотвращает агрегацию клеток, поэтому его нецелесообразно использовать при подсчете лейкоцитов и тромбоцитов.

Доставка, хранение и подготовка проб к исследованию:

-  Исследование крови необходимо проводить либо непосредственно после взятия (исключается возможность спонтанной агрегации тромбоцитов), либо спустя 25 минут (время, необходимое для адаптации тромбоцитов к антикоагулянту) и не позднее 6 часов после взятия крови.

-  При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (4° - 8° С) и исследуют в течение 24 часов. Кровь нельзя замораживать.

-  Исследование крови на приборе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной флагирования  при трехчленной дифференцировке лейкоцитов вследствие сжатия лейкоцитарной гистограммы.

-  При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), нарушения температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов.

-  Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично   закрытые пластиковые пробирки специальные транспортные изотермические контейнеры.

dendrit.ru

Этилендиаминтетрауксусная кислота — Википедия

Материал из Википедии — свободной энциклопедии

Этилендиаминтетрауксусная кислота

({{{картинка}}})
Сокращения EDTA, ЭДТА
Хим. формула C10H16N2O8
Рац. формула (HOOCCH2)2N(CH2)2N(CH2COOH)2
Молярная масса 292,2438 г/моль
Плотность 0,86 г/см³
Температура
 • плавления 237—245 °C
 • разложения 237—245 °C
Константа диссоциации кислоты pKa{\displaystyle pK_{a}} 1,991; 2,672; 6,163, 10,264
Рег. номер CAS 60-00-4
PubChem 6049
Рег. номер EINECS 200-449-4
SMILES
InChI
RTECS Ah5025000
ChEBI 42191
Номер ООН 3077
ChemSpider 5826
NFPA 704
Приведены данные для стандартных условий (25 °C, 100 кПа), если не указано иное.
 Медиафайлы на Викискладе

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА[1][2] от англ. EDTA) — органическое соединение, четырёхосновная карбоновая кислота с химической формулой (HOOCCH2)2N(CH2)2N(CH2COOH)2, белый мелкокристаллический порошок, малорастворим в воде, нерастворим в большинстве органических растворителей, растворим в щелочах, с катионами металлов образует соли этилендиаминтетраацетаты. Получают конденсацией этилендиамина с монохлоруксусной кислотой.

Синонимы и сокращения: комплексон II[2].

Применяют ЭДТА в виде дигидрата двунатриевой соли (комплексон III, трилон Б, Na2-ЭДТА) — в текстильной, кожевенной, бумажной, лакокрасочной промышленности, в производстве металлов, каучука, в цветной кинематографии, для смягчения воды. В аналитической химии ЭДТА позволяет определять более 60 элементов. В медицине ЭДТА используют для выведения из организма радиоактивных и токсичных металлов, для консервации крови и др. В токсикологии кобальтовые соли ЭДТА используются в качестве антидота при отравлении синильной кислотой или хлорцианом. В стоматологии используется при эндодонтической обработке каналов зуба. Для повышения эффективности прохождения корневого канала он размягчает поверхностный дентин. В фармацевтических технологиях ЭДТА применяют для усиления проницаемости лекарств через слизистые оболочки[3].

Также применяется в сельском хозяйстве в виде удобрений (так называемые элементы в хелатной форме). Хелатная форма питательных элементов хорошо усваивается растениями, как при корневой, так и листовой подкормке[источник не указан 383 дня].

В молекулярной биологии ЭДТА используется в растворах для хранения ДНК, т.к. ингибирует действие многих металлозависимых нуклеаз[источник не указан 383 дня].

Модель комплекса, образованного ЭДТА с ионом Cu2+

ЭДТА проявляет низкую острую токсичность при ЛД50 (крысы) от 2,0 г/кг до 2,2 г/кг.[4]Было обнаружено, что она является цитотоксичной и в незначительной мере генотоксичной (выявлено в результате опытов на лабораторных животных). Отмечается, что пероральное введение приводит к изменениям в репродуктивной системе и общем развитии.[5]

ЭДТА имеет столь широкое применение, что поднимается вопрос, является ли этот органический загрязнитель устойчивым. Хотя ЭДТА имеет много важных функций в различных промышленных, фармацевтических и других направлениях, экологическая продолжительность ЭДТА может вызвать серьезные проблемы в окружающей среде. Распад ЭДТА происходит медленно. В основном это происходит абиотично под воздействием солнечных лучей.[6]

Важнейшим процессом для устранения ЭДТА из поверхностных вод является прямой фотолиз при длинах волн ниже 400 нм.[7] Многие комплексы ЭДТА (такие как Mg2+ и Ca2+) в природе встречаются в избыточном количестве и являются устойчивыми.

Исследования также показывают, что ЭДТА оказывает негативное влияние на плодородие почв и урожайность сельскохозяйственных культур.[8] Поскольку ЭДТА увеличивает подвижность тяжелых металлов, их действие негативно отражается и на состоянии почвенной микрофлоры, что в свою очередь негативно влияет на плодородие почвы.

Обычно растения почти не усваивают токсичные для них тяжелые металлы, но ввиду того, что ЭДТА выполняет функцию транспортного агента, эти комплексы попадают в организм растения и приводят к нарушению процессов в клетках, а следовательно влияют на рост и развитие растения в целом. В частности, было обнаружено, что в результате попадания избыточного количества тяжелых металлов в растение может возникать хлороз, замедление ростовых процессов, нарушения метаболизма и снижение способности фиксировать молекулярный азот у бобовых культур. Тяжелые металлы накапливаются в растениях, а в дальнейшем и в сельскохозяйственной продукции, влияя на ее качество.[9]

  1. ↑ Темкина, 1998.
  2. 1 2 БРЭ.
  3. Peter W. J. Morrison, Vitaliy V. Khutoryanskiy. Enhancement in corneal permeability of riboflavin using calcium sequestering compounds // International Journal of Pharmaceutics. — Т. 472, вып. 1—2. — С. 56—64. — doi:10.1016/j.ijpharm.2014.06.007.
  4. ↑ Hart, J. Roger (2005), Ethylenediaminetetraacetic Acid and Related Chelating Agents, DOI 10.1002/14356007.a10_095 
  5. Lanigan, R. S.; Yamarik, T. A. Final report on the safety assessment of EDTA, calcium disodium EDTA, diammonium EDTA, dipotassium EDTA, disodium EDTA, TEA-EDTA, tetrasodium EDTA, tripotassium EDTA, trisodium EDTA, HEDTA, and trisodium HEDTA (англ.) // International Journal of Toxicology (англ.)русск. : journal. — 2002. — Vol. 21 Suppl. 2, no. 5. — P. 95—142. — doi:10.1080/10915810290096522. — PMID 12396676.
  6. ↑ Bucheli-Witschel, M. & Egli, T. (2001), DAB: Environmental Fate and Microbial Degradation of Aminopolycarboxylic Acids, FEMS Microbiology Reviews Т. 25 (1): 69–106, PMID 11152941, DOI 10.1111/j.1574-6976.2001.tb00572.x 
  7. ↑ Kari, F. G. (1994), Umweltverhalten von Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) under spezieller Berucksuchtigung des photochemischen Ab-baus., Swiss Federal Institute of Technology 
  8. ↑ [1]
  9. ↑ http://agropravda.com/news/chimia-dla-rasteniy/11521-primenenie-edta-v-selskom-hozjajstve

ru.wikipedia.org

Хочу все знать

ЭДТА-К2, ЭДТА-К3. Цвет крышки - сиреневый.


      Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) является предпочтительным антикоагулянтом для гематологических исследований. ЭДТА и его щелочные соли способны создавать хелатные соединения с ионами кальция с образованием растворимых высокостабильных комплексов. Наиболее эффективная концентрация ЭДТА – 1,2 мг/мл крови. Во всем мире используют три варианта солей ЭДТА: ЭДТА-К3, ЭДТА-К2 и ЭДТА-Na2. Наиболее предпочтительной и рекомендуемой Международной Комиссией по Стандартизации в Гематологии является двукалиевая соль ЭДТА:

     ЭДТА-К3 показывает меньшую способность поддержания крови в жидком состоянии, также ЭДТА-К3 влияет на подсчет лейкоцитов, занижая их количество. 
различия между ЭДТА-К2 и ЭДТА-Na2 в клиническом плане незначительны и ими можно пренебречь, но ЭДТА-Na2 хуже растворим.

     Для получения качественного результата анализа необходимо:
немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта; 
плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования – 1000-1500G (2000-3000 об/мин). При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4000G c крышечкой и до 12000G без крышечки.

    Наиболее широко используются пробирки, содержащие 1,95 мг ЭДТА/1мл крови. Они нашли свое применение в таких областях лабораторной практики, как:
гематологические исследования – подсчет клеток крови, определение СОЭ и пр. 
ПЦР-исследования (качественные и количественные методики).

    Пробирки с образцами крови можно хранить до 6-10 часов при 4ºС, хранение свыше 24 часов не рекомендуется из-за снижения числа эритроцитов и лейкоцитов.

ЭДТА-К3 для капиллярной крови

     Каждая пробирка содержит специальные добавки (Без капилляра: Pro-coagulation, Clot Activator /Separation Gel, EDTA K2, EDTA K3, Lithium Heparin, Sodium Heparin, NaF/EDTA K2; С капилляром:  Pro-coagulation, Clot Activator /Separation Gel, EDTA K2, EDTA K3, Lithium Heparin, Sodium Heparin, NaF/EDTA K2.) позволяющие осуществлять самые разнообразные виды исследований.

     Пробирки для капиллярной крови выпускаются двух типов: без капилляра и с капилляром.

     Собранная для анализа кровь будет находиться в полной сохранности, ведь крышка, которая очень легко и прочно закрывается, минимизирует аэрозольный эффект. Если Вы используете пробирки с капиллярами, это станет гарантией того, что капиллярная кровь не свернется во время взятия.

biotest-kmv.ru

Значение своевременной диагностики эдта-ассоциированной псевдотромбоцитопении в клинической практике Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ORIGINAL PAPERS

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 616-097:616.151.5:612.12:615.273.5:616.15-07:616.155.294

ЗНАЧЕНИЕ СВОЕВРЕМЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭДТА-АССОЦИИРОВАННОЙ ПСЕВДОТРОМБОЦИТОПЕНИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

© Карина Альбертовна Папаян1, Татьяна Геннадьевна Цветкова2, Эльвира Фаатовна Андреева1, Рустам Алигисмет оглы Шахалиев1, Надежда Нодариевна Немсцверидзе1

1 Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет. 194100, Санкт-Петербург, Литовская ул., 2

2 ВЦЭРм им А.м. Никифорова. 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 4/2.

Контактная информация: Карина Альбертовна Папаян — к.м.н., доцент кафедры факультетской педиатрии. Е-mail: [email protected]

РЕЗЮМЕ. ЭДтА-индуцированная псевдотромбоцитопения — лабораторный феномен, который определяется как ложное снижение количества тромбоцитов, возникающее in vitro при использовании в качестве антикоагулянта этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДтА). На современном этапе проблема ЭДтА-зависимой псевдотромбоцитопении приобрела значительную актуальность вследствие повсеместного введения в практику автоматических гематологических анализаторов, рекомендуемой для которых является кровь, стабилизированная ЭДтА. Этилендиаминтетрауксусная кислота (К2ЭДтА или К3ЭДтА) представляет собой мелкокристаллический порошок белого цвета. она широко применяется в качестве антикоагулянта в лабораторной практике ввиду ряда преимуществ, таких как хорошая растворимость, отсутствие структурных изменений клеток и разведения крови при использовании (в отличие от, например, цитрата натрия). основным механизмом действия ЭДтА является образование малодиссоциирующих соединений с ионами кальция (Са 2+), что ограничивает его взаимодействие с мембранными рецепторами, выключает из системы свертывания крови и, следовательно, тормозит агрегацию и адгезию тромбоцитов при проведении анализов в лаборатории. Своевременное определение у пациентов ЭДтА-зависимой псевдотромбоцитопении является важным диагностическим критерием, необходимым для исключения заболеваний крови и предупреждения возникновения ошибок при выборе тактики лечения.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ЭДтА, псевдотромбоцитопения, тромбоциты, гликопротеин.

THE IMPORTANCE OF TIMELY DIAGNOSIS OF EDTAASSISTED PSEUDOTHROMBOCYTOPENIA IN CLINICAL PRACTICE

© Karina A. Papayan1, Tatiana G. Tsvetkova2, Elvira F. Andreeva1, Rustam oglu A. Shagaliev1, Hope N. Nemsitsveridze1

1 Saint-Petersburg State Pediatric Medical University. 194100, Russia, Saint-Fetersburg, Litovskaya str., 2

2 VTSERM them A.M. Nikiforova. 194044, Saint-Fetersburg, ul. Academician Lebedev, 4/2.

оригинальные статьи

5

Contact Information: Karina A. Papayan — Ph. D., Associate Professor of the Faculty of Pediatrics Department. E-mail: [email protected]

ABCSTRACT. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia (PTCP) is the laboratory phenomenon of a spurious low platelet count which appears in vitro while using EDTA as anticoagulant. The problem of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia has significant relevance due to the widespread using of automated hematology analyzers which EDTA stabilized blood is most recommended for. The mechanism of this phenomenon is based on the production of the specific antibodies causing the platelet aggregation in the presence of EDTA. Ethylenediaminetetraacetic acid (K2EDTA or K3EDTA) is a white crystalline powder. It is widely used in laboratory practice owing to several advantages such as high solubility, lack of cell structure alteration and blood dilution. Early determination of the patients with EDTA-dependent pseudothrombocytopenia is an important diagnostic criterion necessary to exclude blood diseases and prevent errors in treatment.

KEY WORDS: EDTA, pseudothrombocytopenia, platelets, glycoprotein.

введение

Как известно, клинический анализ крови является одним из наиболее часто проводимых исследований для постановки диагноза в практике врачей любой специальности, поэтому вопрос о точности и достоверности данного анализа не теряет своей значимости. Чрезвычайно важно своевременно выявлять все факторы, способные приводить к искажению результатов. К таким факторам относится ЭДТА-индуцированная псевдотромбо-цитопения — лабораторный феномен, который определяется как ложное снижение количества тромбоцитов, возникающее in vitro при использовании в качестве антикоагулянта этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). В данной статье приводится описание феномена, клинических лабораторных критериев, алгоритм диагностики, а также, в качестве примера, разбор клинического случая.

эпидемиология.....

Следует еще раз отметить, что ЭДТА-ин-дуцированная псевдотромбоцитопения является исключительно лабораторным феноменом. Наличие данного явления не влияет на количество тромбоцитов in vivo (оно остается в пределах нормы).

Частота встречаемости в популяции составляет 1:1000. Зависимости от пола, возраста, приема лекарственных средств не наблюдается.

По данным исследований, ЭДТА-индуци-рованная псевдотромбоцитопения одинаково часто встречается как у больных, так и у здоровых людей.

механизм развития

Этиопатогенез феномена до конца не изучен. Известно, что в механизме принимают участие специфичные антитела, циркулирующие в крови только у пациентов с ЭДТА-ассо-циированной псевдотромбоцитопенией. Как показали исследования, по своей природе эти антитела относятся к классу иммуноглобулинов: ^М (10-50% случаев), ДО (30-95%), ^А (5-40%), также в очень редких случаях возможно наличие 2 разных изотипов антител у одного пациента. Оптимальная температура их действия находится в пределах от 4 до 20 °С. Антитела взаимодействуют с видоизмененным рецептором мембраны тромбоцитов — гликопротеином ИЬ-Ша ^РПЬ-Ша), который представляет собой димерный инте-грин, состоящий из двух субъединиц. Образование комплекса между альфа (а11Ь) и бета (Р3) субъединицами напрямую зависит от наличия ионов кальция (рис. 1).

В пробирке под влиянием ЭДТА происходит связывание ионов кальция, которое вызывает диссоциацию комплекса и последующее

ЭДТА — Ca++

Рис. 2. Изменение структуры GPПb-Шa

Ат

ЭДТА — Ca++

Рис. 3. Взаимодействие антител с видоизмененным рецептором у пациентов с ЭДТА-зависимой псев-дотромбоцитопенией

ЭДТА —Ca++

Скопления

Рис. 4. Активация агрегации тромбоцитов в пробе с ЭДтА у пациентов с ЭДтА-зависимой псевдо-тромбоцитопенией

изменение структуры гликопротеина 11Ь-111а (рис. 2), в результате чего происходит обнажение скрытого в физиологических условиях эпитопа. Именно этот участок вступает в реакцию с антителами (рис. 3). Данный процесс провоцирует активацию и агрегацию тромбоцитов в пробе с ЭДТА, что объясняет возникновение ошибочных результатов в анализах крови, в частности псевдотромбоцитопению (рис. 4).

диагностика.....

Для постановки ЭДТА-зависимой псевдо-тромбоцитопении выделяются следующие диагностические критерии:

1. Количество тромбоцитов <100*10А9/л

2. Прогрессирующее с течением времени снижение количества тромбоцитов в пробе с ЭДТА

3. Наличие скоплений только в тех пробах, где в качестве антикоагулянта использовалась ЭДТА

4. Отсутствие клинических проявлений геморрагического синдрома

Постановка диагноза в лабораторной практике требует выполнения определенных анализов, которые проводятся с использованием нескольких антикоагулянтов и с различными временными интервалами. В качестве примера приведем клинический случай.

Пациент Ф.А. А., 15 лет

основной диагноз: единственная (вследствие мультикистоза контрлатеральной) функционирующая викарно гипертрофированная левая почка.

С 2011 года по настоящее время у данного пациента многократно в клинических анализах крови отмечается снижение уровня тромбоцитов на фоне отсутствия геморрагических проявлений.

На первом этапе исследования был произведен подсчет тромбоцитов по Фонио, который выявил их нормальное количество (209*109/л), с одновременным присутствием скоплений кровяных пластинок в мазке крови.

Следующим этапом проводилось исследование на автоматическом анализаторе с ис-

Таблица 1

Динамика уровня тромбоцитов с 2011 г.

Возраст 9 лет 11 лет 12 лет 14 лет 15 лет

PLT, 10Л9/л 65 59 97 49 89 84 68 84 131 92

оригинальные статьи

7

Рис. 5. Скопления тромбоцитов в пробе с ЭДТА через 60 минут после взятия крови

пользованием следующих антикоагулянтов: ЭДТА и цитрат натрия. Было проведено три анализа с ЭДТА с временными интервалами в 10, 60, 120 минут после взятия крови. Параллельно при тех же условиях исследовался образец крови с цитратом натрия: первый анализ через 10 минут, второй — спустя 60 минут после взятия крови. Одновременно с исследованиями на автоматическом анализаторе изучались мазки крови с ЭДТА и цитратом натрия на наличие скоплений тромбоцитов методом световой микроскопии.

В анализах, проведенных через 10 минут от взятия крови, отмечалось нормальное и сопоставимое количество тромбоцитов в пробах и с ЭДТА(177,4*109/л), и с цитратом на-трия(162,0*109/л). Небольшое снижение количества тромбоцитов в пробе с цитратом натрия по сравнению с ЭДТА объясняется наличием разведения (объем используемого цитрата натрия составляет 1 мл).

В анализах, проведенных спустя 1 час после взятия крови, в пробе с ЭДТА было выявлено снижение количества тромбоцитов по данным анализатора(П8,9*109/л), а в мазке обнаруживались скопления, тогда как в пробе с цитратом натрия количество тромбоцитов оставалось в пределах нормы(158,7*109/л), скопления отсутствовали. В анализах, проведенных через 2 часа от взятия крови, в пробе с ЭДТА отмечалось еще более выраженное снижение числа тромбоцитов(104,3*109/л) за счет образования скоплений. Агглютинация тромбоцитов выявлялась только тогда, когда в пробирке присутствовали кальциевые хела-ты ЭДТА, что подтверждает наличие у данного пациента ЭДТА-индуцированной псевдо-тромбоцитопении.

Таким образом, были соблюдены все критерии постановки данного феномена.

заключеиие.....

Как было сказано ранее, актуальность диагностики ЭДТА-ассоциированной псевдо-тромбоцитопении кореллирует с широким распространением автоматических гематологических анализаторов, поэтому необходимо помнить о существовании данного феномена. А также не стоит недооценивать значимость подсчета тромбоцитов по методу Фонио. В заключении следует отметить, что доказанное наличие у пациентов феномена ЭДТА-за-висимой псевдотромбоцитопении позволяет избежать дальнейших диагностических ошибок и необоснованных лекарственных назначений во врачебной практике.

литература

1. Алексеев Н.А. Гематология и иммунология детского возраста. СПб.: Гиппократ; 2009: 166-168, 590-591.

2. Гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови. Министерство здравоохранения и социального развития РФ. Методические рекомендации. М.: 21.03. 2007 N2050-PX.

3. Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: a clinical and epidemiological study of 112 cases, with 10-year follow-up. Am J Hematol. 1995: 103109. D0I:10.1002/ajh.2830500206.

4. Casonato A., Bertomoro A., Pontara E., Dannhauser D., Lazzaro A.R., Girolami A. EDTA dependent pseudo-thrombocytopenia caused by antibodies against the cytoadhesive receptor of platelet gpIIB-IIIA. J Clin Pathol. 1994; 625-630. DOI: 10.1136/jcp.47.7.625.

5. Lin J., Luo Y., Yao S., Yan M. Li J., Ouyang W., and Kuang M. Discovery and Correction of Spurious Low Platelet Counts due to EDTA-Dependent Pseudothrom-bocytopenia. Journal of Clinical Laboratory Analysis 29. 2015: 419-426. DOI 10.1002/jcla.21818.

6. Lippi G., Plebani M. EDTA-dependent pseudothrom-bocytopenia: further insights and recommendations for prevention of a clinically threatening artifact. Clin Chem Lab Med. 2012; 50(8): 1281-1285. DOI 10.1515/cclm-2012-0081.

7. Nishioka T., Yokota M., Tsuda I., Tatsumi N. Flow cy-tometric analysis of platelet activation under calcium ion-chelating conditions. Clin Lab Haematol. 2002; 24(2): 115-119.

8. Sakurai S., Shiojima I., Tanigawa T., Nakahara

K. Aminoglycosides prevent and dissociate the aggregation of platelets in patients with EDTA-dependent

pseudothrombocytopenia. Br J Haematol. 1997; 99(4): 817-823.

9. Savage R.A. Pseudoleukocytosis due to EDTA-in-duced platelet clumping. Am J Clinl Pathol.1984; 81(3): 317-322.

10. van der Meer W., Allebes W., Simon A., van Berkel Y., de Keijzer M.H. Pseudothrombocytopenia: a report of a new method to count platelets in a patient with EDTA- and temperature-independent antibodies of the IgM type. Eur J Haematol. 2002; 69(4): 243-247.

references.....

1. Alekseev N.A. Gematologiya i immunologiya detsk-ogo vozrasta. [Hematology and childhood immunology]. SPb.: Gippokrat; 2009: 166-168, 590-591. (in Russian).

2. Gematologicheskie analizatory. Interpretaciya analiza krovi. [Hematologic analyzers. Interpretation of blood tests]. Ministerstvo zdravoohraneniya i social'nogo razvitiya RF. Metodicheskie rekomendacii. M.: 21.03. 2007 N2050-RH. (in Russian).

3. Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytope-nia: a clinical and epidemiological study of 112 cases, with 10-year follow-up. Am J Hematol. 1995: 103109. D0I:10.1002/ajh.2830500206.

4. Casonato A., Bertomoro A., Pontara E., Dannhaus-er D., Lazzaro A.R., Girolami A. EDTA dependent pseudothrombocytopenia caused by antibodies against

the cytoadhesive receptor of platelet gpIIB-IIIA. J Clin Pathol. 1994; 625-630. DOI: 10.1136/jcp.47.7.625.

5. Lin J., Luo Y., Yao S., Yan M. Li J., Ouyang W., and Kuang M. Discovery and Correction of Spurious Low Platelet Counts due to EDTA-Dependent Pseudothrom-bocytopenia. Journal of Clinical Laboratory Analysis 29. 2015: 419-426. DOI 10.1002/jcla.21818.

6. Lippi G., Plebani M. EDTA-dependent pseudothrom-bocytopenia: further insights and recommendations for prevention of a clinically threatening artifact. Clin Chem Lab Med. 2012; 50(8): 1281-1285. DOI 10.1515/cclm-2012-0081.

7. Nishioka T., Yokota M., Tsuda I., Tatsumi N. Flow cy-tometric analysis of platelet activation under calcium ion-chelating conditions. Clin Lab Haematol. 2002; 24(2): 115-119.

8. Sakurai S., Shiojima I., Tanigawa T., Nakahara K. Aminoglycosides prevent and dissociate the aggregation of platelets in patients with EDTA-dependent pseudothrombocytopenia. Br J Haematol. 1997; 99(4): 817-823.

9. Savage R.A. Pseudoleukocytosis due to EDTA-in-duced platelet clumping. Am J Clinl Pathol.1984; 81(3): 317-322.

10. van der Meer W., Allebes W., Simon A., van Berkel Y., de Keijzer M.H. Pseudothrombocytopenia: a report of a new method to count platelets in a patient with EDTA- and temperature-independent antibodies of the IgM type. Eur J Haematol. 2002; 69(4): 243-247.

cyberleninka.ru

Наполнители для вакуумных пробирок: какие бывают и как работают

Диоксид кремния

Сыворотка крови – жидкая часть крови лишенная форменных элементов и некоторых белков (фибрин и др.) в отличие от плазмы, в которой сохраняются все элементы жидкой части крови кроме форменных элементов.

Получение сыворотки крови является результатом двухступенчатого биохимического процесса: свертывания (коагуляции) крови и ретракции (уплотнения) сгустка. Для запуска коагуляционного каскада необходимо наличие внешнего активатора, каковым может служить диоксид кремния, поэтому процесс свертывания крови быстрее происходит в стеклянных пробирках, так как кремния диоксид является базовым материалом стекла или в пластиковых пробирках с активатором свертывания. Активатор свертывания (clot activator) выполнен в виде напыления на внутренней стенке пробирки.

После образования сгустка начинается этап его уплотнения и выделения сыворотки. На практике ретракция сгустка ускоряется центрифугированием пробирок с кровью.

Для получения максимально чистой сыворотки рекомендуется соблюдение трёх условий:

  1. После забора крови в пробирку в соответствии с инструкцией необходимо осторожно однократно перевернуть пробирку для более полного контакта крови с активатором свертывания;
  2. Дождаться завершения процесса свертывания крови в течение 20-30 минут при комнатной температуре и вертикальном положении пробирки;
  3. Центрифугировать пробирку со свернувшейся кровью не менее 10 минут с ускорением 1500 G (примерно 3000 об/мин) для максимального выдавливания сыворотки из сгустка. При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4000G c крышечкой и до 12000G без крышечки.

После центрифугирования и полной ретракции сгустка сыворотка располагается над сгустком, но в контакте с ним. Сохраняется опасность загрязнения сыворотки составляющими сгустка при неосторожном обращении с пробиркой (встряхивание, опрокидывание и пр.). Для лучшего очищения сыворотки и более полного разграничения сыворотки и сгустка применяются специальные пробирки, содержащие биологически инертный олефиновый гель. Последний представляет собой тиксотропный кополимер, который тяжелее сыворотки, но легче кровяного сгустка, поэтому после центрифугирования гель в виде тонкой полоски занимает промежуточное положение и служит разделительным барьером. Стабильность такого барьера гарантирована в течение 5-7 дней при хранении пробирки с кровью при комнатной температуре.

Оптимальные сроки сохранности образца крови в данных пробирках составляет при комнатной температуре 6 часов, при хранении в холодильнике (+4ºС) – 24 часа. Повторное центрифугирование пробирок, особенно с гелем, не допускается.

Полученная сыворотка крови применяется для очень широкого спектра лабораторных биохимических, ИФА и иммунологических исследований:

  • белковый состав,
  • ферменты,
  • гормоны,
  • онкомаркеры,
  • ВИЧ-инфицирование, гепатиты и пр.

Антикоагулянты для получения цельной крови или плазмы

Не все анализы в клинике делаются из сыворотки крови. Для многих видов исследований необходима цельная кровь, содержащая форменные элементы, или плазма, освобожденная от клеток крови центрифугированием.

Для получения несвернувшейся крови разработаны пробирки с определенными добавками — антикоагулянтами. На практике используют два вида антикоагулянтов:

  1. Ингибиторы (вещества, вызывающие торможение) тромбина. Тромбин играет ключевую роль в коагуляционном каскаде. Он принимает участие в формировании факторов свертывания крови и способствует трансформации фибриногена в фибрин. Добавление биохимических ингибиторов тромбина эффективно активирует антикоагуляционные свойства крови.
  2. Связывание (удаление) ионов Ca2+. При прочих равных условиях свертывание крови происходит при активном участии ионов Ca2+. Удаление их является эффективным механизмом сохранения крови в жидком состоянии.

Гепарин 

Гепарин — кислый мукополисахарид с молекулярной массой 4 000–40 000 – является натуральным антикоагулянтом, присутствующем в любом здоровом организме. Гепарин активирует создание комплексных соединений между антитромбином III и такими факторами свертывания крови, как тромбин, факторы XIIa, XIa, Xa, IXa и VIIa. В таком комплексе факторы свертывания необратимо деактивируются.

Для целей получения плазмы крови в пробирки добавляют литиевую либо натриевую соль гепарина в пропорции к забираемой в пробирку кровью 15-20 МЕ/1 мл, что служит гарантией полной инактивации свертывания крови и не искажает исследуемые параметры. Эритроциты сохраняются в образце крови до 8 часов. Нельзя использовать для проведения анализов образец крови, хранившийся более 48 часов даже в условиях холодильника (+4ºС).

Для получения качественного анализа необходимо немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и гепарина. Плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования – 1 000–1 500 G (2 000–3 000 оборотов/минуту). При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4 000 G c крышечкой и до 12 000 G без крышечки.

В клинике пробирки с гепарином применяются, в основном для проведения исследования электролитного состава крови, газового состава крови и содержания алкоголя в крови.

Не рекомендуется использовать гепарин для:

  • морфологических исследований, так как кислотный характер гепарина способствует обесцвечиванию мазка крови, придавая ему голубоватый оттенок;
  • подсчета лейкоцитов и тромбоцитов, поскольку гепарин стимулирует агрегацию этих клеток крови;
  • исследований по методике полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для более чистого разграничения плазмы крови и сгустка применяются специальные пробирки, содержащие кроме гепарина инертный олефиновый гель. Последний представляет собой тиксотропный кополимер, который тяжелее плазмы, но легче форменных клеток крови, поэтому после центрифугирования гель в виде тонкой полоски занимает промежуточное положение и служит разделительным барьером.

Фторид натрия/ЭДТА калия (серая крышка пробирки)

Добавление фторида натрия и ЭДТА калия в пробирку позволяет предотвратить разрушение глюкозы крови (процесс, называемый гликолизом) и сохранить ее уровень во взятом образце крови.

Фторид натрия и оксалат калия выступают в качестве антикоагулянтов, связывая ионы Са2+ и, кроме того, фторид натрия стабилизирует уровень глюкозы.

Глюкоза разрушается до пирувата и лактата при последовательном осуществлении различных энзиматических реакций. Фторид натрия ингибирует некоторые ферментативные реакции, включая превращение фосфоглицерата в фосфоенолпируватацид, и предотвращает гликолиз.

Для получения качественного результата анализа необходимо немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта. Плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования — 1 000–1 500G (2 000–3 000 оборотов/минуту).

Пробирки с добавлением фторида натрия и оксалата калия используют для проведения определения уровня сахара (глюкозы) в крови. Соотношение компонентов 1/1, общее количество добавляемых реагентов – 4,5 мг/1 мл забираемой в пробирку крови.

Важное про фторид натрия и ЭДТА калия:

  • Фторид блокирует активность уреазы и некоторых других ферментов.
  • Образцы крови из данных пробирок нельзя использовать для прямого определения энзимов.
  • Фторид натрия и ЭДТА калия связывают ион Са2+, заменяя в крови 1 ион кальция на 2 иона натрия или калия.
  • Следствием этого является повышение напряжения ионов в межклеточной жидкости и выкачивание воды из внутриклеточного пространства в межклеточное, сморщивание клеток крови с умеренным “выдавливанием” из эритроцитов гемоглобина. Поэтому видимый гемолиз свойственен образцам крови с данной добавкой.
  • Глюкоза превращается в лактат в результате комплекса реакций, включающего в себя различные этапы. Фторид ингибирует один их последних этапов разрушения глюкозы, начальные этапы с участием гексокиназы и фосфофруктокиназы блокируются менее эффективно, поэтому можно наблюдать снижение содержания глюкозы в образце крови на 6-7% от первоначального.
  • После первоначального незначительного снижения уровня глюкозы ее количество остается постоянным при хранении крови в пробирке в течение 8-10 часов при температуре до 25ºС и в течение 2-3 дней в холодильнике (+4ºС).

ЭДТА-К2 (сиреневая крышка)

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) является предпочтительным антикоагулянтом для гематологических исследований. ЭДТА и его щелочные соли способны создавать хелатные соединения с ионами кальция с образованием растворимых высокостабильных комплексов. Наиболее эффективная концентрация ЭДТА – 1,2 мг/мл крови. Во всем мире используют три варианта солей ЭДТА: ЭДТА-К3, ЭДТА-К2 и ЭДТА-Na2. Наиболее предпочтительной и рекомендуемой Международной Комиссией по Стандартизации в Гематологии является двукалиевая соль ЭДТА:

ЭДТА-К3 показывает меньшую способность поддержания крови в жидком состоянии, также ЭДТА-К3 влияет на подсчет лейкоцитов, занижая их количество.

Различия между ЭДТА-К2 и ЭДТА-Na2 в клиническом плане незначительны и ими можно пренебречь, но ЭДТА-Na2 хуже растворим.

Для получения качественного результата анализа необходимо немедленно после взятия крови осторожно перевернуть пробирку 5-7 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта. Плазма отделяется после центрифугирования. Нормальные скорости центрифугирования — 1 000-1 500 G (2 000–3 000 оборотов/минуту). При необходимости допускается центрифугирование с ускорением 4 000 G c крышечкой и до 12 000 G без крышечки.

Наиболее широко используются пробирки, содержащие 1,95 мг ЭДТА/1мл крови. Они нашли свое применение в таких областях лабораторной практики, как:

  • гематологические исследования – подсчет клеток крови, определение СОЭ и пр. ;
  • ПЦР-исследования (качественные и количественные методики).

Пробирки с образцами крови можно хранить до 6-10 часов при 4ºС, хранение свыше 24 часов не рекомендуется из-за снижения числа эритроцитов и лейкоцитов.

Цитрат натрия (голубая крышка)

Цитрат натрия является антикоагулянтом для сбора венозной крови с це6лью проведения исследований коагуляционных свойств крови.

Процесс свертывания крови представляет собой последовательность сложных реакций, в которых результатом первых реакций (с участием активных ферментов) является активация следующих, первоначально неактивных энзимов. Последним активным ферментом в этой цепочке присутствует тромбин, который осуществляет превращение фибриногена в фибрин. Нити фибрина опутывают клетки крови и окончательно формируют кровяной сгусток. Крайне важную роль на этом этапе играют ионы Са2+. Антикоагуляционные свойства цитрата проявляются в формировании комплекса с ионами Са2+ и эффективном удалении их из крови.

Общее исследование свертывания крови определяется временем, необходимым для последовательной активации ферментов, участвующих в коагуляционном процессе. Проводится определение времени активации и количественное измерение различных составляющих коагуляционного каскада, для чего создаются так называемые “обходные пути” добавлением некоторых промежуточных продуктов свертывания.

Наиболее часто используются пробирки с 3,8% или 3,2% раствором цитрата натрия (0,129 моль/л), соотношение цитрата к количеству забираемой крови 1/9.

Для максимально качественного проведения коагулологических исследований рекомендуется соблюдение определенных правил:

  • нельзя использовать пробирку для взятия крови на коагуляционные тесты первой, сразу после венепункции, так как на результаты может повлиять выделяющийся при пункции тканевой тромбопластин;
  • венозный жгут во время взятия крови в пробирку должен быть снят;
  • немедленно после взятия крови пробирку аккуратно переворачивают 5-6 раз для лучшего перемешивания крови и антикоагулянта;
  • сразу после этого надо проверить количество взятой крови: ее верхняя граница должна быть на уровне голубой полоски на этикетке.

Оптимальными условиями хранения пробирки с образцом крови является температура 20-24ºС и исследование коагуляционных свойств и факторов свертывания крови должно быть проведено в течение 2-х часов с момента взятия крови.

proba-med.ru

Преаналитический этап при исследованиях гемостаза

Для исследования системы гемостаза разработаны и полущили широкое распространение высокоточные приборы и надежные лабораторные методы, которые позволяют быстро и эффективно выявить нарушения, приводящие к кровоточивости или тромбозам, однако их воспроизводимость и точность значимо снижаются при несоблюдении правил и условий преаналитического этапа. Взятие образцов крови, транспортировку и их подготовку для исследования системы гемостаза следует рассматривать как важнейшие этапы полущения корректных результатов,

которым должно быть уделено немало внимания в любой лаборатории, выполняющей исследование системы гемостаза.


ПОДГОТОВКА ПАЦИЕНТА

Кровь для исследования гемостаза забирают утром натощак по прошествии не менее. 8 ч после последнего приема пищи. Важно, чтобы взятие венозной крови проводилось в спокойном состоянии, поэтому перед венепункцией пациенту рекомендуют посидеть в течение 20-30 мин. Для получения надежных результатов при исследовании тромбоцитарного гемостаза за день до сдачи анализа пациенту следует избегать стрессов, физических нагрузок, смены режима дня и изменений в питании, приема алкоголя. Особенно тщательно необходимо соблюдать эти условия при исследовании маркеров активации тромбоцитов (β-тромбоглобулина, тромбоцитарного фактора-4).

Врачу необходимо знать о лекарственных препаратах, которые назначены и вводятся пациент}, поскольку ряд медикаментов способны нарушить агрегацию тромбоцитов или вызвать изменение параметров коагуляции. В подобных ситуациях часто приходится учитывать лишь антикоагулянтный или антитромбоцита р- ный эффект применяемых лекарственных препаратов, поскольку выявить многие нарушения гемостаза на фоне применения антикоагулянтов или антиагрегантов невозможно.

У пациентов в реанимационном отделении нельзя брать кровь из подключичного катетера, поскольку это наиболее частая причина попадания гепарина в образец крови. У пациентов в отделении гемодиализа нельзя осуществлять забор крови из артериовенозной фистулы. Однако при некоторых критических состояниях взятие крови в пробирку или вакутейнер из кубитальной вены бывает невозможно из-за снижения давления. В подобных ситуациях кровь для исследования допустимо взять из подключичного катетера, но при этом следует учитывать, что перечень выполняемых методик будет существенно ограничен вследствие возможного наличия гепарина в образце.


АНТИКОАГУЛЯНТЫ

 

Цитрат натрия

Цитрат натрия связывает ионы кальция и останавливает реакции свертывания. В качестве антикоагулянта для определения большинства показателей коагуляционного и тромбоцитарного звеньев системы гемостаза следует использовать 0,105-0,109 M раствор лимоннокислого натрия, который готовят растворением 3.1-3,2 г Na3C6H507х2H2O в 100 мл воды. Этот раствор следует хранить при температуре от +2 до +8 0C не более 48 ч. При несоблюдении температурного режима в таком растворе развивается микрофлора, вследствие чего концентрация цитрата натрия уменьшается и появляются посторонние примеси, обладающие потенциальной способностью стимулировать тромбоциты и активировать коагуляционные реакции. При наличии рекомендации фирм-производителей реагентов допустимо применение 0,129 M (3,8%) цитрата натрия, однако следует учитывать, что разные концентрации стабилизатора по-разному влияют на ряд показателей коагуляции, в том числе и на МНО. Такое влияние особенно заметно при сравнении реагентов разных производителей.


Этилендиаминтетраацетат

ЭДТА также связывает кальций, останавливая свертывание. Соли этилендиа- минтетраацетата используют для стабилизации образцов, предназначенных для определения клеточного состава периферической крови на гематологических анализаторах. K2-, K3- и Na2-соли ЭДТА в концентрации 1,2-2,0 мг/мл применяют также при дальнейшем исследовании методами ИФА и ПЦР. Недопустимо использование ЭДТА для исследования коагуляции и функциональной способности тромбоцитов.


Гепарин

Гепарин активирует плазменный антитромбин, который необратимо связывает ферментные факторы свертывания. Этот антикоагулянт традиционно применяют в ИФА; как правило, для стабилизации крови необходимо от 12 до 30 ЕД/мл натриевой, калиевой или литиевой соли нефракционированного гепарина. При получении плазмы для исследования ее коагуляционных свойств и функциональной способности тромбоцитов этот антикоагулянт применять нельзя.


ПРОБИРКИ

При взятии и подготовке образцов крови для исследования гемостаза следует применять меры для предупреждения активации тромбоцитов и коагуляционных реакций. Для образцов крови нельзя использовать обычные стеклянные пробирки. поскольку стекло активирует коагуляцию и сорбирует коагуляционные факторы. В течение многих лет для предупреждения этих эффектов использовали силиконирование пробирок, однако появились сведения о недостаточной способности некоторых силиконов предупреждать активацию тромбоцитов. Кроме того, эта процедура трудно стандартизируется и занимает дополнительное время. Как альтернативу силиконированию следует использовать пластиковые пробирки, однако различные сорта пластика также разнятся по способности активировать коагуляционные реакции.

Хорошие результаты дает использование вакуумных систем для взятия крови, содержащих забуференный 3,2% раствор цитрата натрия (буферизация чаще достигается добавкой лимонной кислоты). Цветовая кодировка по ISO/DIS 6710 для вакуумных систем, содержащих цитрат натрия, предусматривает светло- голубой или зеленый цвет колпачков; для пробирок с ЭДТА — лиловый или красный; для пробирок с гепарином — зеленый или оранжевый. Существуют данные о хороших результатах использования специальных CTAD-систем (со стабилизатором, включающим цитрат натрия, трифосаденин, теофиллин и дипиридамол) для определения β-тромбоглобулина, тромбоцитарного фактора-4, PAI-1, контроля гепаринотерапии по АЧТВ или анти-Ха, определения МНО. Однако этот стабилизатор непригоден для исследования функциональной способности тромбоцитов.


ОПТИМАЛЬНОЕ СООТНОШЕНИЕ ЦИТРАТ/КРОВЬ

Поскольку большинство факторов свертывающей системы содержится в плазме, но не в эритроцитах, необходимое количество антикоагулянта зависит от показателя гематокрита у пациента. Для стабилизации образцов крови при значении гематокрита в нормальном диапазоне (от 35 до 50%) принято смешивать один объем 3,2% раствора цитрата натрия с девятью объемами крови. При отклонениях гематокрита от указанных величин следует изменить это соотношение в соответствии с формулой Ingram:

X = V × (100 - НСТ) / (595 - НСТ),

где X — добавляемый объем 3,2% цитрата, мл; V — конечный объем пробирки для крови, мл; HCT — показатель гематокрита у пациента, %.


ТЕХНИКА ВЕНЕПУНКЦИИ

 

ИГЛА И ПРОБИРКА

Для получения образцов венозной крови необходимо привлекать наиболее опытных и квалифицированных процедурных медсестер, способных в течение нескольких секунд пунктировать вену с наименьшими травматичностью и болезненностью для пациента. Медсестре необходимо внимательно ознакомиться с направлением на исследование, выбрать пробирки, определить корректную последовательность их наполнения, промаркировать их и указать время взятия крови. В некоторых специализированных лабораториях на время взятия крови в помощь процедурной медсестре направляют лабораторного техника, что позволяет значительно увеличить пропускную способность процедурного кабинета, снизить вероятность ошибок дозирования цитрата при сдвигах гематокрита и неточностей маркировки проб.

Образец крови предпочтительнее брать из кубитальной вены; место прокола обрабатывают 70% спиртом и дают высохнуть. Допустимо лишь кратковременное (не более 60 с) наложение жгута на плечо, поскольку при венозном стазе происходит активация фибринолиза; после введения иглы в вену жгут тотчас же расслабляют или удаляют. Наилучшие результаты (с учетом травматичности, болезненности, универсальности, скорости наполнения пробирок) дает использование иглы с калибром 21G. Желательно не брать для исследования гемостаза первые 2-3 мл крови, поэтому их набирают в пробирку без антикоагулянта и используют, например, для получения сыворотки (биохимические, иммунологические тесты и др.). Далее пластиковые или силиконированные пробирки с предварительно добавленным цитратом наполняют кровью из иглы самотеком, сразу же закрывают и перемешивают путем 4-6-кратного переворачивания или вращения (без встряхивания). В связи с использованием игл увеличенного диаметра после венепункции в большинстве ситуаций руку пациента необходимо перебинтовать 2- 4 оборотами бинта, приложив к месту прокола марлевый тампон с 70% спиртом.

Наполнять пробирки с цитратом с помощью шприцев для инъекций нельзя, поскольку при насасывании крови и ее последующем переносе в пробирку происходит активация тромбоцитов и коагуляционных факторов вследствие контакта крови с пластиком шприца и дополнительного вспенивания, обусловленного турбулентным движением крови в шприце.


СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ ВАКУУМНЫЕ СИСТЕМЫ

Стандартом для клинических лабораторий, в которых исследуют показатели гемостаза, считается использование одноразовых вакуумных систем (вакутейнеров и др.), содержащих 3,2% раствор цитрата натрия. Их использование в значительной степени ускоряет, стандартизирует процедуру взятия крови и позволяет существенно снизить разброс результатов. Если кровь для исследования показателей гемостаза берут через катетеры или системы с иглой-бабочкой, необходимо обеспечить полную герметичность системы и предварительное заполнение кровью всех «мертвых» объемов — просвета самого катетера, иглы и переходника, иначе возможны частичная потеря вакуума и неполное заполнение пробирки. Для предотвращения этого, а также попадания кусочков поврежденных тканей кровь для анализа показателей гемостаза не рекомендуют брать в первую вакуумную пробирку.

В условиях выраженного сгущения крови (полицитемии, дегидратации и др.) стандартное количество цитрата в вакуумных системах оказывается избыточным для уменьшенного объема плазмы. При использовании вакуумных пробирок и уровне гематокрита у пациента выше 50% часть раствора цитрата из пробирки следует предварительно отсосать (например, с помощью инсулинового шприца). Подлежащий удалению из стандартной вакуумной пробирки объем цитрата можно определить по формуле:

Y = (V / 10) × (9 × HCT - 405) / (595 - НСТ),

где Y — подлежащий удалению объем цитрата, мл; V — конечный объем пробирки для крови, мл; HCT — показатель гематокрита у пациента, %.

При низком (<35%) значении гематокрита, напротив, следует предварительно добавить дополнительное количество цитрата в пробирку, подсчитав его по той же формуле (отбросив знак «минус»).

Однако скорригировать объем цитрата в вакуумных пробирках без нарушения вакуума весьма сложно, и стандартные инструкции производителей вакуумных систем подобной возможности не предусматривают. В связи с этим, поскольку грубые сдвиги гематокрита в диагностической практике встречаются нечасто, при их наличии бывает проще взять кровь с помощью иглы не в вакуумную, а в обычную пластиковую пробирку, предварительно добавив в нее цитрат в соответствии с приведенной выше формулой.


Транспортировка и промежуточный контроль образцов

Следует сократить до минимального интервал времени между взятием образца крови из вены и центрифугированием. До центрифугирования кровь следует хранить при комнатной температуре (от +18 до +24 °С). Недопустимо хранить образцы крови в холодильнике и тем более их замораживать. При охлаждении образцов до 12 °C и ниже начинается холодовая агрегация тромбоцитов. Маркированные образцы транспортируют в лабораторию в специальном контейнере. В том случае, если образцы крови необходимо отправить в другое лечебное учреждение, их нужно транспортировать в термоконтейнере, но без хладагентов. В зимнее время термоконтейнер не позволит образцам охладиться до 12 °C, а в летнее время — перегреться. Направление на исследование или иную медицинскую документацию не следует помещать в контейнер с образцами.

Перед центрифугированием необходимо визуально проверить полученные для исследования пробы крови (маркировку, наличие гемолиза, липемии и сгустков). Образцы, содержащие сгустки, бракуются. Для визуального выявления «подсвертывания» необходимо медленно наклонить пробирку с образцом; при правильных взятии и обработке крови происходит равномерное ее перетекание, соответствующее углу наклона пробирки, и на стенках не остается багровых образований овальной или иной формы.


ПОЛУЧЕНИЕ ПЛАЗМЫ

Богатая тромбоцитами плазма

Цитратная плазма, богатая тромбоцитами, получается при центрифугировании стабилизированной цитратом крови при 150 g в течение 5 мин. Торможение центрифуги должно быть плавным. Сразу же после центрифугирования богатую тромбоцитами плазму переносят в пластиковые пробирки пипетками со сменными наконечниками и используют для исследования агрегационной функции тромбоцитов, которое следует выполнить в течение 2 ч после взятия крови. Замораживание образцов богатой тромбоцитами плазмы недопустимо.

Бедная тромбоцитами плазма

Цитратная плазма, бедная тромбоцитами, обычно еще содержит тромбоциты, но в малых количествах. Для ее получения стабилизированную кровь или плазму, богатую тромбоцитами, центрифугируют при 1700-1900 g в течение 15 мин без охлаждения, а затем надосадочную жидкость переносят в пластиковые пробирки.

Бестромбоцитная плазма

Подобный режим центрифугирования считается достаточным для большинства коагуляционных тестов. Однако в ряде ситуаций, например при определении волчаночного антикоагулянта, проведении dRVV-теста или при необходимости замораживания и хранения материала, требуется бестромбоцитная плазма. Ее получают путем повторного центрифугирования плазмы, бедной тромбоцитами, при 1700-1900 g в течение 15 мин. Следует осторожно относиться к рекомендациям центрифугировать образцы крови с ускорением более 2500 g и охлаждением, поскольку при увеличении центробежной силы и снижении температуры возможно разрушение клеток крови.


Хранение образцов плазмы

Желательно, чтобы функция как тромбоцитарного, так и коагуляционного звена гемостаза была исследована в течение 2 ч после взятия крови у пациента. В большинстве ситуаций обеспечить это довольно сложно, поэтому при условии быстрого отделения плазмы от клеточных элементов допускается исследование коагуляционных показателей в течение 4 ч. Редко выполняемые тесты коагуляционного гемостаза допустимо проводить после накопления замороженных образцов. Хранение плазмы при -20 °С возможно до 4 нед; лучшие результаты получаются при хранении при температуре от -40 до -70 °С. Большинство бытовых холодильников неспособны удерживать температуру -20 ºC, поэтому хранить образцы плазмы в них не рекомендуют. Перед исследованием плазму необходимо быстро разморозить на водяной бане при 37 °С и хорошо перемешать.

www.clinlabs.com


Смотрите также

Женские новости :)